本发明专利技术公开了一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体、基因及应用。所述Ku70蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术利用Ku70蛋白对肿瘤细胞增殖的影响，通过人工改造，构造了可以有效抑制肿瘤增殖的变异型Ku70蛋白Mu4。体外抗肿瘤活性检测和动物实验都表明，改造后的蛋白表现出良好的抗肿瘤增殖特性，可用于研究Ku70参与肿瘤细胞增殖的作用机理，为开发抗肿瘤药物提供理论基础和模型。在医药领域具有一定的应用前景。
A mutant, gene and application of Ku70 protein with the function of inhibiting tumor cell proliferation
【技术实现步骤摘要】
一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体、基因及应用
本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体、基因及应用。
技术介绍
干扰素、白介素是在临床肿瘤治疗中的常用的蛋白药物，但这些药物疗效一般只对部分病人敏感，毒副作用严重还会产生剂量依赖性。随着技术的发展，越来越多的外源性蛋白用于临床肿瘤治疗。Ku蛋白是一类分布广泛的核蛋白，是由Ku70和Ku80两个亚基组成的异源二聚体。近年国内外研究表明Ku70与细胞周期调控，细胞分化程度，细胞核形态以及双链断裂DNA修复相关。研究发现，Ku70之所以可以催化断裂DNA修复是因为它与双链DNA断端的链接是非序列依赖性的方式，DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)和与之结合的蛋白激酶全酶可以通过Ku70招募，这是Ku70较为主要的功能。除此之外，Ku70通过和促凋亡因子Bax结合可以抑制细胞的凋亡；细胞周期检查点相关蛋白Rad3/Rad26途径中Ku70发挥作用可以维持端粒的稳定性。而DNA损伤，修复缺陷和细胞周期调控的异常所导致的基因不稳定常常发生在肿瘤组织中。多项研究表明作为重要的DNA修复蛋白Ku70与多种癌症相关，在宫颈癌，乳腺癌，肺癌等肿瘤组织中，Ku70的表达显著高于正常组织。近年来，Ku70蛋白与肿瘤发生发展的关系被高度关注，是肿瘤治疗研究中的热点。比如，公开号为CN1873410的专利技术公开了一种在食管癌病人血清中检测肿瘤相关标志物的方法，以血清为分子探针，免疫沉淀肿瘤细胞中潜在的肿瘤抗原，富集的肿瘤抗原-抗体复合物经SDS-PAGE电泳分离、考马斯亮蓝染色、特异蛋白条带的酶解消化，肽段抽提，反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离和电喷雾离子化偶联在线离子阱质谱(ESI-IT-MS)鉴定等综合技术路线，筛选食管癌血清标志蛋白。筛选到的Ku70蛋白经免疫印迹实验证实为新的食管癌候选标志物，Ku70蛋白表达明显增高与早期食管癌癌变相关。公开号为CN104211770A的专利技术公开了一类与热休克蛋白结合的神经胶质瘤抗原，包括Survivin-2B抗原肽、Ku70抗原肽和Ku80抗原肽。说明Ku70与神经胶质瘤相关。如果研究人员通过分子生物学方法对Ku70蛋白进行人工改造，开发出一种可抑制肿瘤细胞增殖的外源蛋白，将具有极其重要的药用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种可抑制肿瘤细胞增殖的人工改造外源蛋白，通过体外扩增得到含有该外源蛋白基因的表达载体，通过脂质体转染的方法使得肿瘤细胞表达该蛋白，从而通过细胞增殖活率检测方法来证明该外源蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖。一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术又提供了所述Ku70蛋白突变体在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，其中肿瘤为肺癌或宫颈癌。本专利技术又提供了编码所述Ku70蛋白突变体的基因。优选的，所述的基因，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了所述基因在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，其中肿瘤为肺癌或宫颈癌。优选的，该应用在实施时，将所述基因导入癌细胞内表达出所述Ku70蛋白突变体。本专利技术利用Ku70蛋白对肿瘤细胞增殖的影响，通过人工改造，构造了可以有效抑制肿瘤增殖的变异型Ku70蛋白Mu4。体外抗肿瘤活性检测和动物实验都表明，改造后的蛋白表现出良好的抗肿瘤增殖特性，可用于研究Ku70参与肿瘤细胞增殖的作用机理，为开发抗肿瘤药物提供理论基础和模型。在医药领域具有一定的应用前景。附图说明图1为pBICEP-CMV-3的质粒图谱。图2为GV248的质粒图谱。图3为各组细胞的OD490值比较图。各组细胞分别转染入pBICEP-CMV-Mu4与pBICEP-CMV-Ku70质粒，48小时MTT检测细胞增殖水平，PC9、H1975、ShKu70/HeLa细胞，转染不同质粒组其增殖水平有明显差异；Bel-7402、Hep-G2、HCT-116、293T细胞转染不同质粒组其增殖水平未见明显差异。图4为Mu4蛋白对PC9、H1975、ShKu70/HeLa细胞增殖抑制率柱状图。转染48h后MTT法检测并计算转染pBICEP-CMV-Mu4组与pBICEP-CMV-Ku70组相比细胞增殖抑制程度。ShKu70/HeLa细胞抑制率最高，有55.36％，PC9与H1975细胞的抑制率分别为21.63％和33.33％。表明Mu4对细胞增殖的抑制水平可能与细胞本底的Ku70表达水平相关。具体实施方式实施例1：Mu4蛋白表达载体pBICEP-N-Flag-Mu4克隆构建根据Ku70蛋白的基因全序列(NM_001288977)设计缺失突变引物，用于构建缺失C末端37个氨基酸的变异型Ku70蛋白，突变引物的序列如表1所示。表1突变引物试验室保存的pBICEP-N-Flag-Ku70质粒，该质粒是在商品化质粒pBICEP-CMV-3(购自Sigma公司)的多克隆位点MIuI与BamHI之间插入野生型的全长Ku70基因序列(质粒图谱见图1)。以pBICEP-N-Flag-Ku70质粒为模板，通过突变PCR方法获得pBICEP-N-Flag-Mu4质粒DNA片段，所述PCR反应体系如表2所示。表2PCR扩增体系模板DNA1μl上游引物(10μM)1μl下游引物(10μM)1μlDreamTaqPCRMasterMix(2×)25μlSterileMilli-QWater22μl总体积50μlPCR反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，共18个循环；72℃延伸10min。将Ku70蛋白突变所得的突变体命名为Mu4蛋白，Mu4蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；Mu4基因序列如SEQIDNo.2所示。将得到的pBICEP-N-Flag-Mu4质粒DNA片段转化到感受态细胞JM109中扩增，提取阳性菌落并测序验证。获得真核表达载体pBICEP-N-Flag-Mu4。实施例2：Mu4蛋白对ShKu70/HeLa细胞增殖抑制活性检测(1)筛选ShKu70/HeLa细胞采用脂质体转染的方法，向HeLa细胞内转入Ku70ShRNA质粒。Ku70ShRNA质粒购自吉凯公司，质粒图谱(GV248质粒)如图2所示，在多克隆位点内插入Ku70ShRNA的编码序列(如SEQIDNo.5所示)。该质粒转染入细胞内，可表达出靶向Ku70mRNA的ShRNA，从而抑制Ku70的表达，降低细胞内的Ku70蛋白水平。转染24小时后，向培养基中加入1μg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.如权利要求1所述Ku70蛋白突变体在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，肿瘤为肺癌或宫颈癌。
4.编码如权利要求1所述Ku70蛋白突变体的基因。
【专利技术属性】
技术研发人员：贾静，王屹喆，汤湛，贾振宇，郑晓亮，王孝举，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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