本发明专利技术提供一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成和应用，该荧光染料通过萘酰亚胺4,5‑位刚性环的引入达到了荧光稳定性、亮度得到大幅度提升，其结构式如(1)所示，该类染料在水中荧光量子产率最高可达0.80以上，荧光发射波长在495nm左右，半峰宽小于35nm，能有效避免串色现象。在不同微环境下该类染料能够保持荧光信号的稳定性，对温度、极性等均不敏感。此外，由于活性酯的存在该类染料能够用于标记抗体、多肽等生物分子，实现对目标物的监测与荧光成像。
High brightness and stability fluorescent dyes containing active esters and their synthesis and Application
【技术实现步骤摘要】
含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成和应用
本专利技术属于荧光标记领域，具体涉及一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成和应用。
技术介绍
由于灵敏度高、原位实时响应、检测周期短的优势，荧光分析法在各研究领域(如：荧光PCR检测、抗体标记等)已经被广泛应用于识别与标记，其能够通过荧光信号将微观的信息变化以宏观的形式显示出来。而荧光分析法应用的同时也催动着荧光分子向更高亮度、更高稳定性发展，其中有机小分子荧光染料凭借易修饰、可选择性多、颜色丰富等特点备受研究工作者的青睐。借助活性酯基团即可实现有机小分子荧光染料与目标物氨基基团的共价连接，达到稳定的荧光标记。目前，用于荧光分析的有机小分子荧光染料主要为共振(resonant)染料，拥有窄的吸收与发射峰、溶剂不敏感、斯托克斯位移小、高摩尔消光系数及高量子产率等特点，如罗丹明、花菁染料、荧光素等。但是此类染料分子本身会带有电荷，严重影响分子的标记性能、稳定性、相容性，如荧光素分子负离子容易被氧化为淬灭，不易穿透细胞膜；花菁染料的聚甲炔链极易被单线态氧进攻，烯烃的扭转导致量子产率降低等。尤其在超分辨与单分子检测技术蓬勃发展的时代，有机小分子荧光染料的稳定性、亮度仍需进一步提高，亟需高亮度、高稳定、相容性好的中性荧光小分子的出现。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料，该类染料为不带电荷中性分子，在水中量子产率最高可达0.80以上，可用于对目标物氨基的修饰。本专利技术的另一目的是提供一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，该方法步骤简单、易于提纯、通用性好等优点。本专利技术提供一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料，通过萘酰亚胺4,5-位刚性环引入达到荧光稳定性、亮度得到大幅度提升。该类染料呈现出共振染料亮度高、半峰宽窄等优势的同时保持自身不带电荷的特性，对多种微环境变化均不敏感，保持了荧光信号的准确性。一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料，该系列荧光探针具有如下结：R1为中的一种；其中n为0-2整数。一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，此系列荧光探针合成路线，如下：具体合成步骤如下：(1)中间体N-(酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺COEt-NBr的合成：将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，1-氨基脂肪酸酸乙酯盐酸盐，三乙胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺COEt-NBr；(2)中间体N-(酯基)烷基-4,5-二脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺COEt-DF的合成：将COEt-NBr系列化合物，溶于乙二醇甲醚中，向其中加入脂肪环胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(酯基)烷基-4,5-二脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺COEt-DF；(3)中间体N-1-(羧基)烷基-4,5-二脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺COOH-DF系列化合物COEt-DF系列化合物溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液。室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得COOH-DF系列化合物；(4)带有NHS活性基团的荧光染料合成将COOH-DF系列化合物，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min。N-羟基琥珀酰亚胺溶于1mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中。2-5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比4～20:1的二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂，除去溶剂后得NHS活性基团的荧光染料染料；步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、1-氨基脂肪酸酸乙酯盐酸盐、三乙胺的质量比为1:1-3:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL；步骤(2)中，N-(酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪环胺的质量比为1:0.5-3；N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-20:1mg/mL；所述脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环己二胺；步骤(3)中，COEt-DF系列化合物的质量与甲醇的体积比为10-20:1mg/mL；；COEt-DF系列化合物的质量与2M氢氧化钠溶液的体积比为10-20:1mg/mL；；COEt-DF系列化合物的质量与水的体积比为10-20:1mg/mL；步骤(4)中，COOH-DF系列化合物、DCC、NHS质量比为1:1-5:1-10；BCOOH-DAC的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20:1mg/mL。一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料在抗体的荧光标记领域的应用。一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料在荧光成像领域的应用。上述一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料能够用于对含有氨基等亲核基团的目标物进行荧光标记，荧光亮度高、稳定性强，在荧光成像、标记领域有较大应用前景。本专利技术具有以下特点：本专利技术涉及的荧光染料拥有合成原料低价、方法简单通用等优点。本专利技术涉及的荧光染料4,5-位刚性结构的引入使荧光量子产率大幅升，水中量子产率在0.80以上，摩尔消光系数达到40000M-1/cm-1以上。本专利技术涉及的荧光染料能够通过活性酯与生物大分子氨基残基进行缩合达到对生物大分子的稳定荧光标记。本专利技术涉及的荧光染料对于温度、黏度、极性等微环境均不敏感，能够最大限度保持荧光信号的准确性。附图说明图1实施例1制备的COOH-DAze的核磁谱图氢谱。图2实施例2制备的COOH-DAC的核磁谱图氢谱。图3实施例3制备的NHSB-DAC的核磁谱图氢谱。图4实施例1制备的探针COOH-DAze在水中的归一化紫外吸收与荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化强度，荧光染料的浓度为10μM。图5实施例2制备的探针COOH-DAC在氯仿、水中的归一化荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。图6实施例3制备的探针NHSB-DAC标记的细胞内骨架结构的荧光共聚焦成像图。具体实施方式实施例1NHSM-DAze的合成中间体2-(N-(4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺))氨基乙酸乙酯(COMe-NBr)的合成4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中加入甘氨酸乙酯盐酸盐(1000mg，7.17mm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于该荧光染料结构如下：/n
【技术特征摘要】
1.一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于该荧光染料结构如下：
R1为中的一种；
其中n为0-2整数。
2.如权利要求1所述的一类含活性酯的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-(酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺COEt-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，1-氨基脂肪酸酸乙酯盐酸盐，三乙胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺COEt-NBr；
(2)中间体N-(酯基)烷基-4,5-二脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺COEt-DF的合成：
将COEt-NBr系列化合物，溶于乙二醇甲醚中，向其中加入脂肪环胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(酯基)烷基-4,5-二脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺COEt-DF；
(3)中间体N-1-(羧基)烷基-4,5-二脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺COOH-DF系列化合物
COEt-DF系列化合物溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液。室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得COOH-DF系列化合物；
(4)带有NHS活性基团的荧光染料合成
将COOH-DF系列化合物，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min。N-羟基琥珀酰亚胺溶于1mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中；2-5...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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