本发明专利技术提供了一种488nm激发的免洗Halo‑tag探针及其合成和生物应用，该探针基于萘酰亚胺染料，其结构式如(1)所示；该探针通过具有强烈环张力的氮杂环丁烷实现了对分子内扭转的抑制，从而使该Halo‑tag探针能够保持高的量子产率与稳定性。此外，该探针在水中的最大激发在482nm，适用于488nm激发下进行荧光成像。该探针能够实现对活细胞内融合有Halo‑tag的目标蛋白特异性标记，达到免洗荧光成像，在单分子检测、超分辨荧光成像等领域有较好的应用前景。
A 488 nm excitation FREE HALO tag probe and its synthesis and biological application
【技术实现步骤摘要】
一种488nm激发的免洗Halo-tag探针及其合成和生物应用
本专利技术属于蛋白标签领域，具体涉及一种488nm激发的免洗Halo-tag探针及其合成和生物应用。
技术介绍
有机小分子荧光染料具有尺寸小、荧光发射光谱宽泛、可选择荧光颜色多样等优点，这也使其逐渐成为荧光蛋白的替代者被广泛应用与蛋白荧光标记。标签蛋白的出现使小分子荧光染料能够通过特异性的酶促反应共价连接至标签蛋白，从而间接实现对目标蛋白的稳定标记。其中，Halo-tag作为一种非人源的脱卤素酶的变异体被广大研究工作者所青睐，Halo-tag能够与含有卤代脂肪烃的荧光染料发生特异性反应，使两者之间通过稳定的酯键连接。Halo-tag的应用也伴随着不同荧光探针的开发，其中488nm激发下的探针应用最为广泛。此波段的探针的识别基团通常为氯代己烷，荧光团位荧光素或罗丹明123类染料。荧光素的发光形态为负离子形式，不仅稳定性较差，同时细胞渗透性较低；而罗丹明类染料虽然克服了细胞渗透性和光稳定性问题，但是线粒体聚集的特点使活细胞内荧光成像信噪比较差，会造成荧光信号的误差。因此，488nm波段下的Halo-tag探针仍然匮乏，稳定性、细胞渗透性、相容性需要进一步提高。此外，近几年迅速发展的单分子荧光成像技术对此类探针稳定性要求更为苛刻。
技术实现思路
本专利技术的目的一种488nm激发的免洗Halo-tag探针及其合成和生物应用。一种488nm激发的免洗Halo-tag探针，该探针能够实现活细胞内的免洗荧光成像。一种488nm激发的免洗Halo-tag探针的合成方法，该方法步骤简单、纯化简单、原料低廉等优点。本专利技术一种488nm激发的免洗Halo-tag探针，通过在萘酰亚胺分子4,5-位引入两个刚性四元环结构提高了荧光稳定性、亮度，该探针在水中量子产率大于0.20，所述的Halo-tag荧光探针具有如下结构：一种488nm激发的免洗Halo-tag探针，通过具有强烈环张力的氮杂环丁烷实现了对分子内扭转的抑制，从而使该Halo-tag探针能够保持高的量子产率与稳定性。该探针在水中的最大激发在482nm，适用于488nm激发下进行荧光成像一种488nm激发的免洗Halo-tag探针的合成方法，该荧光探针的合成方法及合成路线，如下：具体合成步骤如下：(1)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成：将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和二甘醇胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(OAN-NBr)；(2)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-二氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺(Halo-OH)的合成：将中间体OAN-NBr溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体Halo-OH；(3)Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成：将中间体Halo-OH与氢化钠置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针Halo-DAze。步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：二甘醇胺的质量比为3:1-12；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL。步骤(2)中，中间体OAN-NBr：氮杂环丁烷的质量比为3:1-30；中间体OAN-NBr的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:100-600g/mL。步骤(3)中，中间体Halo-OH：氢化钠的质量比为10:1-15；中间体Halo-OH的质量与1-碘-6-氯己烷的体积比为6:2-15g/mL；中间体Halo-OH的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:100-250g/mL。一种488nm激发的免洗Halo-tag探针能够特异性识别Halo-tag蛋白，在活细胞等复杂环境中实现对Halo-tag的免洗荧光成像。一种488nm激发的免洗Halo-tag探针在活细胞及组织内对Halo-tag及其融合蛋白成像领域的应用。一种488nm激发的免洗Halo-tag探针在Halo-tag蛋白的识别与检测领域的应用。一种488nm激发的免洗Halo-tag探针在单分子检测中的应用。一种488nm激发的免洗Halo-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。本专利技术的Halo-tag探针拥有合成原料低廉、提纯简单等优点。该Halo-tag探针分子在水中荧光量子产率均大于0.20，摩尔消光系数大于40000M-1cm-1，亮度高，光稳定性高于同波段的荧光素、罗丹明类染料。该Halo-tag探针能够对活细胞内Halo-tag蛋白进行特异性识别，达到免洗荧光成像，信噪比高。此外，该探针可用于SIM等超分辨荧光成像。该Halo-tag探针能够实现对活细胞内融合有Halo-tag的目标蛋白特异性标记，达到免洗荧光成像，在单分子检测、超分辨荧光成像等领域有较好的应用前景。附图说明图1为实施例1制备的Halo-DAze的核磁谱图氢谱。图2为实施例1制备的Halo-DAze的高分辨质谱。图3为实施例1制备的探针Halo-DAze在水中归一化的荧光激发光谱与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化强度，荧光染料的浓度为10μM。图4为实施例1制备的探针Halo-DAze在500W钨灯照射下495nm处荧光强度随时间变化图，选取商业罗丹明123、荧光素作为参比染料，横坐标为时间，纵坐标为归一化荧光强度。图5为实施例1制备的探针Halo-DAze在转染的pHALOf-H2B的HeLa细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。图6为实施例1制备的探针Halo-DAze在在转染的Hela细胞SIM超分辨荧光成像图，荧光探针的浓度为1μM。具体实施方式实施例1Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成方法。中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成：4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(2.00g，6.24mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(1.97g，18.7m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种488nm激发的免洗Halo-tag探针，其特征在于该探针的结构如下所示：/n
【技术特征摘要】
1.一种488nm激发的免洗Halo-tag探针，其特征在于该探针的结构如下所示：
2.一种如权利要求1所述的一种488nm激发的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于包含步骤如下：
(1)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和二甘醇胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(OAN-NBr)；
(2)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-二氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺(Halo-OH)的合成：
将中间体OAN-NBr溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体Halo-OH；
(3)Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成：
将中间体Halo-OH与氢化钠置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针Halo-DAze。
【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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