一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种488nm激发的免洗SNAP‑tag探针及其制备方法，该免洗SNAP‑tag探针是在4,5‑位双取代的萘酰亚胺染料中引入螺环刚性结构并设计合成的一系列可用于488nm激发的免洗SNAP‑tag探针，其结构式如(1)所示。刚性结构的引入不仅限制了分子内扭转，提高了荧光分子的稳定性及亮度，还增加了探针分子的平面性。这导致SNAP‑tag探针分子在水中形成强烈π‑π作用，导致荧光的淬灭。而与SNAP‑tag结合后，探针分子荧光得到释放，最高可增强28倍。该系列探针能够实现活细胞内对SNAP‑tag的特异性标记，达到免洗荧光成像。此外，由于稳定性及亮度的提升，该系列探针还可用于SIM(结构光照明显微镜)，STED(受激辐射损耗)等超分辨荧光成像领域。

A 488 nm excited and washless snap tag probe and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针及其制备方法
本专利技术属于蛋白标记领域，具体涉及一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针及其制备方法。
技术介绍
荧光成像技术已经逐渐成为在细胞层次到个体水平研究蛋白质功能的强有力工具。由于具有尺寸小、荧光发射光谱宽泛、可选择荧光颜色多样等优点，有机小分子荧光染料在蛋白标记领域逐渐成为荧光蛋白的替代者。但是有机小分子染料是外源物种，存在的问题是不能够像荧光蛋白一样由细胞源生，所以无法控制在细胞中的数量以及细胞中的位置。为了解决这个问题，化学家发展了多种生物正交的方法将小分子染料共价连接到目标蛋白上，从而可以进一步跟踪研究目标蛋白的位置和功能。其中，目前应用最广泛的是蛋白标签技术，该技术通过遗传编码的方法首先将标签蛋白融合到目标蛋白上，然后这种蛋白标签与荧光底物发生专一的酶促共价连接反应，从而实现将小分子荧光染料特异性连接到目标蛋白的目的。利用蛋白标签技术实现活细胞蛋白成像时，荧光底物需要满足多种性能要求，至少包括荧光底物具有良好的细胞透膜性、与蛋白标签之外的生物大分子无结合，与蛋白标签反应快、蛋白标记前后荧光有明显变化以提高信噪比等。其中，自由的荧光染料无荧光或很弱，与蛋白标签标记后荧光显著增强，这样的荧光信号能够有效避开背景荧光以及没有反应的荧光底物的干扰。这一性能使染料在进行活细胞成像时可以省掉多次洗细胞这样的有损细胞的操作。SNAP-tag标签法已经成为目前应用最为广泛的蛋白质标记技术，通过其与目标蛋白的融合可以对目标蛋白进行示踪、功能的监测等。目前，已有多种商业的SNAP-tag荧光染料被开发出来，其主要是基于环境不敏感的罗丹明与花菁染料。这类染料能够与SNAP-tag能够达到很高的反应速率，但是反应前后荧光变化较小(通常增加1-2倍)。因此，在对细胞着色后需要多次洗涤才能达到比较好的染色效果。而对于环境敏感型染料，由SNAP-tag结合前水环境到结合后的疏水的蛋白表面会使其荧光增强倍数增加，有可能会达到免洗的效果；此外SNAP-tag探针还可以基于聚集诱导淬灭、PET等机制实现荧光背底的减弱。由此可见，对于SNAP-tag探针的设计有多种方式可以遵循，如何通过合适的方式达到最佳识别效果一直是科研工作者研究的重要方向。尤其在单个蛋白功能研究的今天，单分子和超分辨成像等技术对荧光染料稳定性和亮度提出高要求的同时，对荧光信号真实性也提出了更高的需求，而背景增高会造成错误信号的增加，无法得到可信的成像结果。因此，设计出光稳定更好、反应速率更高的免洗SNAP-tag荧光探针显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针，该系列探针与SNAP-tag蛋白结合后荧光增强倍数可达28倍，可实现活细胞内的免洗荧光成像。本专利技术的另一目的是提供一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针的制备方法，该方法具有通用性，相比于目前嘌呤引入方法拥有步骤简单、易于提纯等优点。本专利技术提供一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针，以萘酰亚胺为荧光团，通过4,5-位刚性结构的调节使萘酰亚胺的荧光稳定性、亮度得到大幅度提升，实现了SNAP-tag蛋白的免洗超分辨荧光成像。此外，萘酰亚胺由环境敏感型染料蜕变为环境不敏感型荧光染料，在与SNAP-tag结合前后荧光峰型及波长不随极性变化而发生变化，保持了荧光信号的准确性。一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针，该系列荧光探针具有如下结构：其中，R2为中的一种。R2为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH等；R3为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH。n位0,1,2,3.一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针的制备方法，此系列荧光探针合成路线，如下：具体合成步骤如下：(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)；(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪环胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺；(3)SNAP-tag探针的合成将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针；一类如权利1所述的一系列488nm激发的免洗SNAP-tag探针在细胞、组织及活体内对目标蛋白的荧光成像的应用。步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：4-氨甲基苄醇的质量比为1:0.5-2；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL；步骤(2)中：N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪环胺的质量比为1:1-3；N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-200g/mL。脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、乙二胺衍生物等。步骤(3)中：N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-5:1-5；N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:80-200g/mL。上述一系列免洗SNAP-tag探针对SNAP-tag蛋白具有高度选择性，能够在复杂环境中对SNAP-tag进行特异性识别。一类488nm激发的免洗SNAP-tag探针在识别与检测SNAP-tag蛋白中的应用。一类488nm激发的免洗SNAP-tag探针在超分辨成像中的应用。一类488nm激发的免洗SNAP-tag探针在细胞、组织及活体内对目标蛋白的荧光成像的应用。本专利技术具有以下特点：本专利技术涉及的SNAP-tag探针拥有合成原料低价、方法简单通用等优点。本专利技术涉及的SNAP-tag探针在水中分子间发生聚集而导致荧光淬灭，而在结合SNAP-tag蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针，其特征在于该探针的结构如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针，其特征在于该探针的结构如下：



其中，R1为中的一种。
R2为H、C1-4烷基或(CH2CH2O)nH；
R3为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH。n位0,1,2,3。


2.如权利要求1所述的一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪环胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺；
(3)SNAP-tag探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21