【技术实现步骤摘要】
一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法
本专利技术涉及水产养殖
，特别涉及一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法。
技术介绍
中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)属甲壳纲、十足目、弓蟹科的一属，又称毛蟹、河蟹，广泛分布于中国南北沿海各地湖泊、池塘和河流。中华绒螯蟹具有生长快、食性杂、易饲养、病害少等养殖优势，同时因其肉味鲜美、富含低胆固醇蛋白质，作为营养保健食品而风靡全国。70年代起中国开始进行中华绒螯蟹人工育苗，并在繁殖生物学、自然水温育苗等方面进行了初步研究，目前中华绒螯蟹在江苏、安徽和浙江等多个省份均有大量养殖，其2018年的养殖产量达到了756877吨。近年来，随着养殖规模和养殖密度的不断增大，各种疾病频发，导致中华绒螯蟹养殖业受到极大的挑战。国内已有报道中华绒螯蟹在野生和养殖环境中对多种病毒较为敏感，包括白斑综合征病毒、中华绒螯蟹小核糖核酸病毒和呼肠孤样病毒等。此外，中华绒螯蟹在特定条件下也容易爆发革兰氏阴性细菌病，目前已报道的能够导致中华绒螯蟹...
【技术保护点】
1.一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1：造血组织分离及鉴定/n从待取样中华绒螯蟹上剥离造血组织，经形态学观察，鉴定并确定其为造血组织后再用于后续步骤；/n步骤2：造血组织细胞及培养/n将造血组织置于混合消化液中消化，经细胞筛过滤后离心，去除上清液后用L-15培养基重悬细胞，重复操作3遍后，用L-15培养基重悬获得造血组织细胞悬浮液，计数后将细胞浓度调整至1×10
【技术特征摘要】
1.一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：造血组织分离及鉴定
从待取样中华绒螯蟹上剥离造血组织，经形态学观察，鉴定并确定其为造血组织后再用于后续步骤；
步骤2：造血组织细胞及培养
将造血组织置于混合消化液中消化，经细胞筛过滤后离心，去除上清液后用L-15培养基重悬细胞，重复操作3遍后，用L-15培养基重悬获得造血组织细胞悬浮液，计数后将细胞浓度调整至1×105cells/mL，置于24℃无CO2恒温培养箱中培养，连续观察7日并拍摄每日细胞形态；
步骤3：免疫增强剂安全浓度测试
3.1将步骤2培养后的造血组织细胞浓度调整至1×105cells/mL，并按200μL/孔加入96孔板，置于24℃无CO2恒温培养箱中培养24h；
3.2选取待选免疫增强剂用L-15培养基溶解后，经0.22μm滤膜过滤后备用；
3.3用L-15培养基对免疫增强剂进行对半稀释，调整各免疫增强剂终浓度至100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.7mg/mL、3.4mg/mL、1.7mg/mL和0.85mg/mL；
3.4将3.1步96孔板中的培养液吸出，用L-15培养基清洗2遍，每孔加入200μL梯度浓度的免疫增强剂，每个浓度3孔重复，于24℃无CO2恒温培养7天；
3.5每日收集1次细胞观察并拍照，以3孔重复不出现细胞病变为安全浓度；
步骤4：免疫增强剂作用关键基因检测
4.1根据中华绒螯蟹Astakine和Beta-actin基因设计荧光定量RT-PCR引物，于安全浓度的免疫增强剂作用细胞后的第1、2、3、4、5、6和7天，收集各孔细胞并提取RNA；
4.2采用反转录试剂盒将提取的RNA合成荧光定量PCR用cDNA第一链；
4.3接着进行荧光定量PCR检测Astakine和Beta-actin基因的CT值，并用2-△△Ct计算后确定不同免疫增强剂作用下Astakine基因的相对表达情况；
步骤5：免疫增强剂投喂
5.1制备含免疫增强剂的免疫增强型颗粒饲料和不含免疫增强剂的颗粒饲料；
5.2选择幼蟹作为实验对象，投免疫增强型颗粒饲料为试验组，投不含免疫增强剂的颗粒饲料为对照组，每日按蟹体重的3％投免疫增强型颗粒饲料和不含免疫增强剂的颗粒饲料；
5.3于特定时间作如下分析：
5.3.1于投喂后的0、1、2、3、4和5周收集蟹造血组织，提取造血组织的RNA并用荧光定量RT-PCR检测Astakine和Beta-actin基因的CT值，用2-△△Ct计算计算Astakine基因的相对表达量；
5.3.2于投喂5周后完整剥离造血组织，并分别对造血组织及蟹体重进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕孙建，张海琪，刘莉，袁雪梅，施伟达，杭小英，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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