一株连续传代的飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一株飞蝗细胞系QAU‑Lm‑E‑17及其制备方法和应用，涉及昆虫细胞生物学和害虫生物防治技术领域。本发明专利技术所述飞蝗细胞系QAU‑Lm‑E‑17的保藏编号为CCTCC No.C2019123。本发明专利技术所述飞蝗细胞系QAU‑Lm‑E‑17为国内外首次建立的可连续传代的飞蝗细胞系，所述飞蝗细胞系QAU‑Lm‑E‑17可支持专性寄生物蝗虫微孢子虫的离体增殖，为飞蝗生理学和蝗虫微孢子虫的深入研究提供有价值的实验材料。

A continuous cell line qau-lm-e-17 and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一株连续传代的飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17及其制备方法和应用
本专利技术属于昆虫细胞生物学和害虫生物防治
，具体涉及一株连续传代的飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17及其制备方法和应用。
技术介绍
飞蝗(Locustamigratoria)属直翅目，飞蝗科，是一种多食性、迁飞性大害虫。飞蝗喜食小麦、玉米、高粱、水稻等多种禾本科植物，也可为害棉花、大豆、蔬菜等。大面积发生时成群迁飞，把成片的农作物吃成光秆，危害极大。二十世纪80年代以来，受全球异常气候变化和某些水利工程失修或兴建不当以及农业生态与环境突变的影响，飞蝗在我国黄淮海地区频繁发生，每年发生面积约100～150万公顷，农业生产受到严重威胁。蝗虫微孢子虫(原命名为Nosemalocustae，现命名Paranosemalocustae，同义Antonosporalocustae)是专一寄生于蝗虫的病原微生物，通过胃毒作用主要侵染宿主的脂肪体，可导致蝗虫生长发育缓慢、活动能力及食量下降、产卵量降低，发病严重的蝗虫最终死亡。蝗虫微孢子虫具有对人畜安全、不污染环境等特点，能够长期持续保存在蝗虫种群中，降低害虫密度，在蝗虫的生物防治和可持续治理中发挥了重要作用。深入研究蝗虫微孢子虫与宿主的相互作用以及互作分子进化机制，将为更好地利用蝗虫微孢子虫防治蝗虫提供理论指导。由于活虫体内组织结构和各因素之间的复杂性，使得相关研究变得复杂和困难，而离体昆虫细胞培养将为上述研究提供一个更加简单、快捷和准确的工具和手段。自1959年Gaw成功建立家蚕(Bombyxmori)传代细胞系和1962年Grace建立了桉蚕(Antheraeaeucalypti)细胞系以来，目前已从150多种昆虫中建立了800多株细胞系，在昆虫病原的基础研究、生物杀虫剂的生产、重组蛋白表达以及基因功能的研究等领域发挥着越来越重要的作用。目前建立的昆虫细胞系中主要以鳞翅目和双翅目昆虫为最多，有关直翅目昆虫细胞系成功建立的报道还较少，报道的主要有血黑蝗(Melanoplussanguinipes)、埃及蚂蚱(Anacridiumaegyptium)、剑角蝗(Poekiloceruspictus)、螽斯(Gampsocleisgratiosa)等。一些研究者也曾尝试对飞蝗的卵巢和胚胎细胞进行原代培养，但到目前为止，还未有飞蝗连续传代细胞系成功建立的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一株连续传代的飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17，明确了飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17的细胞生物学特性以及蝗虫微孢子虫的离体侵染特性，可用于蝗虫微孢子虫的离体增殖及其致病机理研究。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一株连续传代的飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17，于2019年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C2019123。本专利技术提供了所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17的制备方法，包括以下步骤：将消毒后的飞蝗卵冲洗后研磨，磨碎卵粒提取细胞滤液，将所述细胞滤液加入培养基中进行培养，在所述培养期间每隔14d换一半体积的新鲜培养基；所述培养基以TNM-FH培养基为基本培养基，还包括以下体积百分含量的组分：20％的胎牛血清、0.1％的海藻糖和0.01％的庆大霉素。优选的，所述飞蝗卵为飞蝗产卵7～13d的卵块。优选的，所述消毒包括依次进行的次氯酸钠消毒和酒精消毒；所述次氯酸钠消毒为利用体积百分含量为10％的次氯酸钠水溶液消毒5min；所述酒精消毒为利用体积百分含量为75％酒精水溶液消毒5min。优选的，所述研磨为在过滤网上进行，所述过滤网的孔径为100μm。本专利技术还提供了所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17或利用所述制备方法制备得到的飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17在离体增殖蝗虫微孢子虫中的应用。优选的，所述离体增殖蝗虫微孢子虫的方法，包括以下步骤：将感染微孢子虫的飞蝗若虫，进行表面消毒后，解剖所述蝗虫若虫提取脂肪体，将所述脂肪体在第二过滤网上研磨后收集脂肪体滤液，利用所述脂肪体滤液接种所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17后，在28℃的条件下进行培养；所述第二过滤网浸泡于增殖培养基中，所述增殖培养基以TNM-FH培养基为基本培养基，还包括以下体积百分含量的组分：20％的胎牛血清、0.1％的海藻糖、0.01％的庆大霉素和0.025％的两性霉素B；所述第二过滤网的孔径为40μm。优选的，所述飞蝗若虫为感染微孢子虫10d后的3龄飞蝗若虫，解剖前饥饿24h。优选的，所述表面消毒包括依次进行的次氯酸钠消毒和酒精消毒；所述次氯酸钠消毒为利用体积百分含量为10％的次氯酸钠水溶液消毒10min；所述酒精消毒为利用体积百分含量为75％酒精水溶液消毒10min。优选的，所述接种时，微孢子虫的孢子和所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17中细胞的数量比为20:1。本专利技术提供了一株飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17，经过对所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17线粒体COI基因片段的扩增和序列分析发现，扩增的飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17线粒体COI基因片段长度为657bps，序列已提交到GenBank(登录号为MN395672，SEQIDNO.1)，利用在NCBI中进行Blast比对，与数据库中飞蝗的线粒体COI基因(登录号为JN858163.1，SEQIDNO.3)最大的相似率为100％，证明该细胞系为飞蝗细胞系；对飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17进行核型分析时，发现所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17的染色体数目在21～26个之间，全部为端着丝粒，其中21个染色体的占比最多，为40％，23和24个染色体的占比分别为10％和7％，与飞蝗染色体雄性为2n＝23和雌性为2n＝24相比，数目上略有变化。本专利技术所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17为国内外首次建立的可连续传代的飞蝗细胞系，也首次报道了该细胞系可支持专性寄生物蝗虫微孢子虫的离体增殖，为飞蝗生理学和蝗虫微孢子虫的深入研究提供有价值的实验材料。附图说明图1为本专利技术所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17的形态图；图2为本专利技术所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17感染蝗虫微孢子虫的形态图；图3为飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17线粒体COI基因核苷酸比对图。生物保藏信息飞蝗(Locustamigratoria)细胞系QAU-Lm-E-17，于2019年6月21日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C2019123。具体实施方式本专利技术提供了一株连续传代的飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17，于2019年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C2019123。本专利技术所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17的形态如图1所示，细胞主要为梭形和圆形两种形态，还有较少部分棒状细胞，其中梭形细胞最多，占比59.7％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株连续传代的飞蝗(Locusta migratoria)细胞系QAU-Lm-E-17，其特征在于，于2019年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.C2019123。/n

【技术特征摘要】
1.一株连续传代的飞蝗(Locustamigratoria)细胞系QAU-Lm-E-17，其特征在于，于2019年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C2019123。


2.权利要求1所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将消毒后的飞蝗卵冲洗后研磨，磨碎卵粒提取细胞滤液，将所述细胞滤液加入培养基中进行培养，在所述培养期间每隔14d换一半体积的新鲜培养基；所述培养基以TNM-FH培养基为基本培养基，还包括以下体积百分含量的组分：20％的胎牛血清、0.1％的海藻糖和0.01％的庆大霉素。


3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述飞蝗卵为飞蝗产卵7～13d的卵块。


4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述消毒包括依次进行的次氯酸钠消毒和酒精消毒；所述次氯酸钠消毒为利用体积百分含量为10％的次氯酸钠水溶液消毒5min；所述酒精消毒为利用体积百分含量为75％酒精水溶液消毒5min。


5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述研磨为在过滤网上进行，所述过滤网的孔径为100μm。


6.权利要求1所述飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17或利用权利要求2～5任一项所述制备方法制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑桂玲，李长友，李洁，韩佳辰，孙雨，王宪辉，侯丽，康乐，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37