一株暗黑鳃金龟胚胎细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株对杀暗黑鳃金龟幼虫Bt Cry8类杀虫蛋白敏感的细胞系，为暗黑鳃金龟细胞系QAU‑Hp‑E‑9‑2，其保藏编号为CCTCC No:C201867。本发明专利技术的细胞系，可用于杀暗黑鳃金龟幼虫Bt杀虫晶体蛋白的活性筛选和离体生物测定。本发明专利技术以暗黑鳃金龟胚胎组织为材料，建立该昆虫的细胞系并克隆筛选，获得一株对Bt Cry8类杀虫蛋白敏感的细胞系，对其相关的生物学特性进行研究，为对暗黑鳃金龟具有活性杀虫蛋白的筛选、离体生物测定以及杀虫机理研究提供材料。

An embryonic cell line of the black gill golden turtle and its application

【技术实现步骤摘要】
一株暗黑鳃金龟胚胎细胞系及其应用
本专利技术属于昆虫细胞生物学
，具体涉及一株暗黑鳃金龟细胞系及其应用，可用于杀蛴螬类害虫苏云金芽胞杆菌Cry8类杀虫晶体蛋白的毒力测定和杀虫机理研究。
技术介绍
暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)是一种世界性的农业害虫，在中国的20余个省均有分布，是许多地区花生、豆类、粮食作物和草坪等植物的主要地下害虫。其成虫和幼虫(俗称蛴螬)均能为害，成虫主要取食寄主植株的叶片、花等地上器官；而幼虫常年在土壤中生活和取食，咬断寄主幼苗根部、咬伤植物嫩茎和其他地下组织，导致农产品品质下降、作物缺苗断垄，严重地块绝产绝收。由于暗黑鳃金龟幼虫生活在地下、隐蔽为害，生活周期和为害时间长，防治非常困难。目前防治暗黑鳃金龟的措施主要包括化学防治、农业防治、物理防治和生物防治等几个方面。其中化学防治见效较快、效果较好，是目前主要的防治手段。但长期以来依赖化学药剂防治，一些高毒农药的不合理使用导致环境污染和农残超标等问题，同时还容易使害虫产生抗药性以及对天敌生物产生负面影响。因此，生产上迫切需要研发绿色、无污染、高效专一的防治技术对暗黑鳃金龟进行有效防治。苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一类包括许多亚种并对多种昆虫具有高毒力的产晶体芽胞杆菌，Bt可产生具有杀虫活性的晶体蛋白(或毒素)，这些蛋白常被作为生物杀虫剂直接施用或在转基因作物中表达而得到广泛应用。二十世纪80年代以前，有关Bt的研究和应用主要集中在鳞翅目和双翅目害虫上，而对鞘翅目金龟甲科的研究相对较少。自从Ohba等(1992)首次筛选获得了一株对多种金龟子幼虫具有特异杀虫活性的Bt新菌株Buibui，并应用该菌株防治铜色丽金龟Anomalacuprea取得较好防治效果后，引起了人们对利用Bt防治蛴螬的极大兴趣和广泛关注。目前国内外已分离了至少30多个对蛴螬具有杀虫活性的Bt菌株，其中含有的BtCry8类杀虫蛋白基因对蛴螬类害虫具有特异活性。目前国内外已克隆了60个Cry8类杀虫晶体蛋白基因，其中Cry8Ab、Cry8Ea、Cry8Ga、Cry8Na等Cry8类杀虫蛋白对暗黑鳃金龟幼虫具有杀虫活性，这些Bt菌株的分离以及杀虫蛋白基因的发掘为暗黑鳃金龟等蛴螬类害虫的生物防治开辟了一条新途径。目前国内外主要采用活体昆虫进行杀虫活性物质的筛选、生物测定和杀虫机理研究，由于活体生物测定周期长，费力费时，而且昆虫的敏感性受季节、温度、昆虫品系等因素的影响较大。尤其是蛴螬类害虫的生活周期长，暗黑鳃金龟一般需要1年完成1个世代，且饲养比较困难，成为限制杀虫活性物质筛选、生物测定和杀虫机理深入研究的一个瓶颈。相对于活虫测定而言，离体培养的昆虫细胞较活体昆虫均一性好，细胞生长周期短，不易受环境和昆虫体内环境的影响。因此，昆虫离体细胞为杀虫剂的活性筛选、毒力测定以及作用机理的研究提供了简单、准确的新方法和理想的体外模型，在体外药物筛选、杀虫剂毒力测定和昆虫抗药性研究等方面发挥着重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株对杀暗黑鳃金龟幼虫BtCry8类杀虫蛋白敏感的细胞系，从而弥补现有技术的不足。本专利技术提供一株暗黑鳃金龟细胞系QAU-Hp-E-9-2(HolotrichiaparallelacelllineQAU-Hp-E-9-2，简称Hp-9-2)，其于2018年4月17日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo:C201867。本专利技术的细胞系，可用于杀暗黑鳃金龟幼虫Bt杀虫晶体蛋白的活性筛选和离体生物测定。本专利技术提供了细胞系QAU-Hp-E-9-2的分子鉴定方法，用线粒体细胞色素氧化酶I亚基(COI)基因引物进行PCR扩增，通过分析和比对基因序列来鉴定细胞系，其COI基因核苷酸序列见SEQIDNO:1，其蛋白序列见SEQIDNO:2。所述的引物对，其序列信息如下：上游引物HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′(SEQIDNO:3)、下游引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′(SEQIDNO:4)。本专利技术以暗黑鳃金龟胚胎组织为材料，建立该昆虫的细胞系并克隆筛选，获得一株对BtCry8类杀虫蛋白敏感的细胞系，对其相关的生物学特性进行研究，为对暗黑鳃金龟具有活性杀虫蛋白的筛选、离体生物测定以及杀虫机理研究提供材料。附图说明图1：本专利技术的暗黑鳃金龟细胞系Hp-9-2的细胞形态；图2：本专利技术的暗黑鳃金龟细胞系Hp-9-2的生长曲线图；图3：不同Bt杀虫蛋白处理暗黑鳃金龟细胞系Hp-9-2的形态变化图，其中(A)PBS缓冲液处理的细胞，(B)Cry1Ac1蛋白处理的细胞，(C)Cry8Ab1蛋白处理的细胞，(D)Cry8Ea2蛋白处理的细胞。具体实施方式不同种类的蛴螬对不同的BtCry8类杀虫蛋白的敏感性不同，Cy8Ab1对暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟幼虫均具有杀虫活性，Cry8Ea2对暗黑鳃金龟幼虫具有防治效果，而对华北大黑鳃金龟则没有活性。本专利技术对暗黑鳃金龟胚胎细胞系进行建立和克隆，用Cy8Ab1和Cry8Ea2两种杀虫蛋白进行筛选获得敏感细胞系Hp-9-2，对细胞系进行分子鉴定、生长曲线测定以及对BtCry8类杀虫蛋白敏感性测定等进行研究，该细胞系对杀暗黑鳃金龟幼虫的BtCry8类杀虫蛋白敏感，将在杀虫蛋白的活性筛选和离体生物测定中具有良好的应用前景。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：暗黑鳃金龟细胞系的建立(1)暗黑鳃金龟胚胎细胞的原代培养在室内饲养暗黑鳃金龟成虫，待成虫交配产卵后每天收集卵粒，用于细胞培养。细胞原代培养方法参照郑桂玲等(2010)的方法(郑桂玲,李长友,周洪旭,李淑文,李国勋,薛明.2010.两株棉铃虫胚胎新细胞系的建立及其对杆状病毒侵染的反应.昆虫学报,53(2):167-174.)，将分离的胚胎细胞接种于含15％胎牛血清(FBS)的TNM-FH培养基中，在28℃培养箱中静置培养，根据细胞的生长状态，每隔15～20d更换不同比例的新鲜培养基。培养24h的暗黑鳃金龟胚胎细胞开始贴壁，逐渐伸长拉网并形成网状基质，1个月后从网状基质中开始有新生细胞分裂出来，随着细胞逐渐分裂，细胞量不断增加，原代培养4个月的细胞逐渐铺满细胞培养瓶瓶底，可以进行传代培养。(2)暗黑鳃金龟胚胎细胞的传代培养待原代培养的细胞生长至铺满培养瓶瓶底后，在超净工作台内用吸管轻轻吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液。按2:3的比例(2mL细胞悬液加入3mL15％FBS的TNM-FH培养基)进行传代。待细胞稳定传代10次后，更换为含10％FBS的TNM-FH培养基继续培养，以1:4的比例在28℃条件下每隔7d传代一次，细胞生长逐渐稳定，建立了一株暗黑鳃金龟胚胎细胞系QAU-Hp-E-9(简称Hp-9)。...

【技术保护点】
1.一种暗黑鳃金龟细胞系，其特征在于，所述的暗黑鳃金龟细胞系的保藏编号为CCTCCNo:C201867。/n

【技术特征摘要】
1.一种暗黑鳃金龟细胞系，其特征在于，所述的暗黑鳃金龟细胞系的保藏编号为CCTCCNo:C201867。


2.权利要求1所述的暗黑鳃金龟细胞系在Bt杀虫晶体蛋白的活性筛选中的应用。


3.权利要求1所述的暗黑鳃金龟细胞系在离体生物测定中的应用。


4.权利要求1所述的暗黑鳃金龟细胞系在蛴螬类害虫杀虫剂筛选中的应用。


5.一种筛选蛴螬类害虫杀虫剂的方法，其特征在于，所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：李长友，郑桂玲，李苗苗，李洁，张保华，于乾龙，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37