无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及应用制造技术

本发明专利技术属于微生物领域，具体涉及无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及应用。所述菌株对鱼类、小鼠、鸡等动物无致病力，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.19466。用1.1×10

Non pathogenic luminous bacterium of Mermaid and its application

【技术实现步骤摘要】
无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及应用
：本专利技术属于微生物领域，具体涉及无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及应用。
技术介绍
：美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)广泛分布于全球海洋环境中，是弧菌科(Vibrionaceae)发光杆菌属(Photobacterium)的一种重要致病菌，包括美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(P.damselaesubsp.damselae,PDD)和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(P.damselaesubsp.piscicida,PDP)两个亚种，其中PDP只感染鱼类，而PDD不仅可以感染多种海洋动物，还可以感染人类发病。PDD由美国科学家Love等人首次报道于1981年的Science杂志，分离自患皮肤溃疡病的雀鲷科鱼类Chromispunctipinnis的皮肤病灶处。在该文献中，Love等也提到了PDD感染人类发病的案例。随后，世界各地陆续有PDD感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟等不同海洋动物发病的案例，该菌甚至可以感染鲸豚类等海洋哺乳动物而发病。1982年，Morris等人在TheLancet杂志社首次对PDD感染人类发病的症状进行了描述，证实该菌可以导致伤口感染、流脓和难以愈合等症状。1985年，美国科学家首次报道了PDD感染人类9天后导致死亡的病例。1993年，香港和美国科学家各自报道了1例PDD感染人类导致急性死亡的病例，死亡时间缩短至感染后3天左右。随后，在2004年日本和美国科学家又报道了3例PDD感染人类导致严重的筋膜炎而致死的病例。这些已报道的病例证实了PDD对人类具有极强的致病力，也说明PDD是一种少见的对人类具有致死能力的人鱼共患病原，其在海水养殖环境中广泛分布，不仅会对养殖生产造成经济损失，可能还会对养殖生产从业者造成一些潜在的公共卫生风险，应引起足够的重视。在前期的研究中，本专利申请人在我国主要的海水养殖区针对PDD开展了系统性的流行病学调查，陆续从我国的山东、河北、江苏、海南等不同地区分离、保存了30余株PDD菌株。后续的病原学研究发现，这些菌株PDD不仅生理生化指标、抗生素药物敏感性等常规表型指标存在较明显的差异外，对鱼类和小鼠的致病力也表现了非常明显的差异，同为108cfu/mL的活菌液注射感染，致病力强的菌株可以导致实验鱼和小鼠在极短的时间内全部死亡，而无致病力的菌株注射的受试鱼和小鼠在整个实验期间却无死亡现象发生。此外，以鱼、鸡和小鼠为免疫对象，无致病力和强致病力的PDD菌株也表现了显著的抗原差异性。因此，针对无致病力和强致病力的PDD菌株开展研究，有助于开发更加精准的检测技术和免疫防控产品，指导养殖生产高效、全面、有效的防控该菌传播和流行。
技术实现思路
：本专利技术要解决的技术问题，是提供一株对鱼类、小鼠等实验动物无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium.damselaesubsp.damselae)菌株Pdd0909。为解决上述问题，本专利技术通过以下技术方案实现：一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium.damselaesubsp.damselae)菌株Pdd0909，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年3月12日，保藏编号为：CGMCCNo.19466。本专利技术的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd0909，是分离自海水养殖环境的天然无致病力菌株，用1.1×108cfu/ml的活菌液注射许氏平鲉、大菱鲆、小鼠、鸡等多种动物，不会造成实验动物的发病或死亡，证实该菌对动物无致病力。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株的用途。为解决上述问题，本专利技术通过以下技术方案实现：一种无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株的用途，用于制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种疫苗。本专利技术的有益效果在于：提供了一种具有无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd0909，对动物具有无致病力。因其抗原性与美人鱼发光杆菌美人鱼亚种强致病力菌株存在差异性，因此用于制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种疫苗时，可以与强致病力菌株实现抗原互补，从而进行多效价的疫苗制备，以实现对不同抗原差异的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株的全免疫保护保护。附图说明图1美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd0909的形态；其中，a：在TSB琼脂培养基上的菌落形态；b：在TCBS琼脂培养基上的菌落形态；c:电镜下的菌株形态。图2美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd0909在羊血培养基上的溶血表型特征；图3注射美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd0909与其他3株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株后许氏平鲉的死亡曲线。具体实施方式：为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：一株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，拉丁名称为Photobacterium.damselaesubsp.damselae，实验室编号为Pdd0909，分离自海水网箱养殖环境，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年3月12日，保藏编号为：CGMCCNo.19466。1.菌株的分离过程该菌株是从网箱养殖许氏平鲉的海水环境中分离获得的。具体分离过程为：从许氏平鲉溃疡病发病养殖网箱的中心点2米深处采集2L海水水样，用0.22μm孔径的无菌纤维素滤膜进行抽滤。随后，在无菌操作台中将滤膜倒置，用100mL无菌1.5％NaCl溶液进行反抽滤，吸取200μL的滤液在TSB琼脂培养基上进行涂布培养24h后，挑取培养基上优势菌的一个单菌落，转接至另一个新的TSB琼脂培养基上进行再次划线培养24h，挑取一个新的单菌落再次转接至一个新的TSB琼脂培养基上进行划线培养24h，培养温度均为28℃。连续进行单菌落纯化培养3次后，获得的纯培养物即是本专利技术所述的菌株。2.菌株的鉴定过程初步鉴定：菌落形态：将菌株Pdd0909在TSB琼脂培养基上培养18～24h(培养温度为28℃)后，结果显示呈白色不透明圆形菌落，表面光滑，中央隆起，直径多在1-2mm左右(图1a)。在TCBS上同样可以生长，但是菌落不变黄色(图1b)。透射电镜观察,菌株呈长杆状、具单根极生鞭毛,菌体大小约为(1.8～2.2)×(0.5～0.8)μm(图1c)。即可初步断定菌株Pdd0909为美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株。进一步鉴定：将上述获得纯培养物菌株提取细菌总体DNA，分别用引物对A：5'-TGAAATTGCCCAACTGTCCC-3'，5'-TCACTTACTTGGGCCACATC-3'；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株(Photobacterium.damselaesubsp./ndamselae)，其特征在于：所述菌株对鱼类、小鼠、鸡等动物无致病力，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.19466。/n如权利要求1所述的无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，其特征在于：用1.1×10

【技术特征摘要】
1.一种无致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株(Photobacterium.damselaesubsp.
damselae)，其特征在于：所述菌株对鱼类、小鼠、鸡等动物无致病力，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCCNo.19466。
如权利要求1所述的无致病力...

【专利技术属性】
技术研发人员：张正，于永翔，王印庚，王凯，施琳妮，张浩，廖梅杰，荣小军，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37