一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用技术

本发明专利技术公开了一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用，能够明显提高发酵单位，降低硫酸庆大霉素产品的杂质，符合《中国药典》(2015版)的要求。改进前硫酸庆大霉素的发酵单位<2000u/ml；生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂＞11％，西索米星＞9％，小诺霉素＞2.5％。本发明专利技术硫酸庆大霉素的发酵单位>4500u/ml，平均为5007u/ml，较改进前提高176％；生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂＜5％，平均为3.06％，较改进前降低75％；西索米星＜2％，平均为1.55％，较改进前降低84％；小诺霉素＜2.5％，平均为2.37％，较改进前降低9％。

A mutant strain of Micromonospora purpurea, its preparation method and application in the preparation of gentamicin sulfate

【技术实现步骤摘要】
一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用
本专利技术涉及一种绛红小单孢菌突变型菌株，具体涉及一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用。属于抗生素发酵

技术介绍
硫酸庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，对各种革兰阴性细菌及革兰阳性细菌都有良好抗菌作用。硫酸庆大霉素的作用机制是与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成；使用现有庆大霉素菌种及生产配方进行发酵生产，发酵单位低，产品杂质高，很难符合《中国药典》2015版的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用，以解决硫酸庆大霉素传统生产中存在的发酵单位低、杂质高等问题。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：1、一种绛红小单孢菌突变型菌株，该菌株为绛红色小单孢菌(Micromonosporapurpurea)CH20190225-107，已于2019年12月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.19254。2、上述一种绛红小单孢菌突变型菌株的制备方法，先将绛红小单孢菌GM20190109-15(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC11015，中文名：绛红小单胞菌，拉丁名：Micromonosporapurpurea)制备成孢子悬液，然后利用ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪进行诱变并培养成诱变后的单菌落，再筛选在波长325nm下吸收峰高的单菌落，接种培养得发酵液，选择发酵单位高、杂质低的单菌落菌种，后处理即得所述的绛红小单孢菌突变型菌株CH20190225-107冷冻管孢子。优选的，具体步骤如下：1)以福安药业集团烟台只楚药业有限公司菌种库中的庆大霉素生产菌株绛红小单孢菌GM20190109-15为出发菌种，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行斜面孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到GM20190109-15菌种的斜面孢子；2)取1.0cm2步骤1)制备的斜面孢子加入灭菌的含5ml质量浓度0.9％的生理盐水的三角瓶中，震荡20min，得到孢子悬液；3)取500μl步骤2)制备的孢子悬液，加入250μl质量浓度20％的氯化锂水溶液，250μl质量浓度0.9％的生理盐水，震荡混匀5min，得到含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液；震荡混匀后用移液枪吸取20μl含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液置于ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪的样品器中进行诱变，诱变时间设置为60秒，得到诱变后的孢子悬液；4)将步骤3)制备的诱变后的孢子悬液分别稀释至10-4、10-5、10-6、10-7，分别取稀释至10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液100μl，涂布于含有分离培养基的双碟培养皿中，培养温度35～37℃，静置，培养时间4天，得到诱变后的单菌落；5)使用灭菌后的牙签分别挑取步骤4)制备的诱变后的单菌落，并对每个单菌落编号，分别接种于灭菌后的含种子培养基的24孔板每个孔中，每个孔的编号与单菌落编号对应，培养温度35～37℃，摇床转速220r/min，培养42小时，将24孔板每个孔中的种子培养液分别取0.3ml接种于灭菌后的含斜面培养基的24孔板每个孔中和灭菌后的含发酵培养基的24孔板每个孔中，每个孔的编号与单菌落编号对应，接种后的含斜面培养基的24孔板，培养温度35～37℃，静置，培养4天，留种待用，接种后的含发酵培养基的24孔板，培养温度35～37℃，摇床转速220r/min，培养时间120小时，将发酵24孔板每个孔中的发酵液用20％浓硫酸酸化至pH1.5～2.0，混匀静置20min，在孔板离心机上以3000转/分钟离心5分钟，分别取每个孔中的上清液20μl置于96孔板对应的孔中，96孔板每个孔中加入160μlOPA(邻苯二甲醛)衍生试剂、820μl纯化水，60℃水浴15min，置酶标仪上检测，得到在波长325nm下吸收峰高的单菌落编号；6)根据步骤5)得到吸收峰高的单菌落编号找到步骤5)制备的含斜面培养基的24孔板对应的单菌落菌种，将单菌落菌种分别取1.0cm2接种于灭菌后的含60ml斜面培养基的250ml茄子瓶斜面中，培养温度35～37℃，静置，培养时间4天，得到斜面孢子，取1.0cm2斜面孢子分别接种于灭菌后的含100ml种子培养基的750ml摇瓶中，培养温度35～37℃，摇床转速220r/min，培养42小时，得到种子培养液，分别取10ml种子培养液接种于灭菌后的含100ml发酵培养基的750ml摇瓶中，培养温度35～37℃，摇床转速220r/min，培养时间120小时，得到发酵液；7)将步骤6)制备的发酵液加质量浓度20％硫酸溶液酸化至pH1.5～2.0，混匀静置20min，定性滤纸(中速)过滤，取0.2ml滤液进高效液相色谱仪检测发酵单位及组份，液相条件：色谱柱为AgilentZorbaxSB-C18，柱温为30℃，流动相为甲醇：水相：乙酸＝710：240：50(体积比)，流速1.5ml/min，检测波长为330nm；8)根据步骤7)高效液相色谱仪检测数据，选择发酵单位高、杂质低的单菌落菌种编号，根据编号找到对应的步骤6)制备的斜面孢子，得到突变菌株CH20190225-107斜面孢子；9)将步骤8)制备的突变菌株CH20190225-107斜面孢子于生物安全柜上用接种棒全部刮下，移入灭菌后的装有100ml质量浓度20％甘油水溶液的250ml三角瓶中，搅匀后用灭菌后的10ml吸管吸取质量浓度20％甘油孢子悬液8ml分装于灭菌后的10ml离心管内，塞好棉塞，置-80℃冰柜冷冻保存，得到绛红小单孢菌CH20190225-107冷冻管孢子。进一步优选的，步骤1)中，以重量百分比计，所述斜面培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装60ml，经湿热灭菌后，斜放凝固，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。进一步优选的，步骤4)中，以重量百分比计，所述分离培养基的配方为：可溶性淀粉1.2％，葡萄糖0.6％，碳酸钙0.06％，酵母浸出粉0.25％，琼脂1.8％，余量为水；配制好的分离培养基经湿热灭菌后，分装于灭菌后的直径90mm的双碟培养皿中，每个双碟培养皿分装40ml，湿热灭菌条件为0.11MPa，121℃，30分钟。进一步优选的，步骤4)中，由绛红小单孢菌GM20190109-15为出发菌株，经ARTP(常压室温等离子体)和氯化锂诱变产生的突变株，菌落为棕色，边缘无明显色圈，在孢子斜面培养基上生长周期为4天。进一步优选的，步骤5)中，以重量百分比计，所述种子培养基的配方为：淀粉3.0％，豆粉2.0％，硫酸亚铁0.0005％，氯化钴0.0003％，碳酸钙0.3％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绛红小单孢菌突变型菌株，其特征在于，该菌株为绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)CH20190225-107，已于2019年12月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.19254。/n

【技术特征摘要】
1.一种绛红小单孢菌突变型菌株，其特征在于，该菌株为绛红色小单孢菌(Micromonosporapurpurea)CH20190225-107，已于2019年12月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.19254。


2.权利要求1所述一种绛红小单孢菌突变型菌株在硫酸庆大霉素制备中的应用。


3.一种硫酸庆大霉素的制备方法，其特征在于，先利用权利要求1所述绛红小单孢菌突变型菌株CH20190225-107进行孢子培养得到代2孢子斜面，然后经三次扩大培养得到三级种子培养物，接着进行发酵培养获得庆大霉素发酵产物，后处理即得一种硫酸庆大霉素产品。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)将绛红小单孢菌CH20190225-107冷冻管孢子，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到代1孢子斜面，取代1孢子斜面1.0cm2接种于灭菌后的斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到代2孢子斜面；
2)将步骤1)中得到的代2孢子斜面，于生物安全柜上，将孢子全部刮下，置于灭菌后的纯化水中混合均匀，按照1g孢子加10ml纯化水的比例制成孢子悬液，孢子悬液置于一级种子培养基中进行扩大培养，孢子悬液接入量为一级种子培养基体积的千分之一，培养温度为34～36℃，培养时间为72小时，得到一级种子培养物；
3)将步骤2)得到的一级种子培养物置于灭菌后的二级种子培养基中进行扩大培养，一级种子培养物接入量为二级种子罐培养基体积的20％，培养温度为34～36℃，培养时间为45小时，得到二级种子培养物；
4)将步骤3)得到的二级种子培养物置于灭菌后的三级种子培养基中进行扩大培养，二级种子培养物接入量为三级种子罐培养基体积的100％，培养温度为34～36℃，培养时间为20小时，得到三级种子培养物；
5)将步骤4)得到的三级种子培养物置于灭菌后的发酵培养基中进行培养，三级种子培养物接入量为发酵培养基体积的100％，培养温度为34～36℃，发酵培养20小时后开始补入灭菌后的732树脂，732树脂补入量为发酵液体积的7％，培养时间为200～250小时，得到庆大霉素发酵产物；
6)将步骤5)得到的庆大霉素发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛祥斌，徐鹏，杨春敬，叶晖，刘阳，孟晓妍，姜喜元，张文浩，
申请(专利权)人：福安药业集团烟台只楚药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37