一种响应面法优化枯草芽孢杆菌生产脂肽类抗生素的方法技术

本发明专利技术公开了一种响应面法优化枯草芽孢杆菌生产脂肽类抗生素的方法，属于微生物发酵领域，其中使用的枯草芽孢杆菌为Z‑5菌株，该菌株于2014年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.8925。针对该菌株通过响应面法确定了其最优的发酵条件为玉米粉3.85％，黄豆饼粉1.57％，FeSO

A response surface methodology to optimize the production of lipopeptide antibiotics by Bacillus subtilis

【技术实现步骤摘要】
一种响应面法优化枯草芽孢杆菌生产脂肽类抗生素的方法
本专利技术属于微生物发酵领域，尤其涉及一种响应面法优化枯草芽孢杆菌生产脂肽类抗生素的方法。
技术介绍
植物病害一直是农作物优质高产的重要制约因素之一。在植物病害中，70％～80％的病害是病原真菌侵染所引致的。植物真菌病害不仅直接造成农作物产量下降与品质降低，而且部分病原真菌在侵染农作物过程中，可分泌产生多种对人畜有害的毒素与代谢物，对农产品的安全性构成极大威胁。生物防治绿色环保，病原菌不易产生耐药性。生防菌剂生产工艺较简单、且能促进作物生长。目前直接利用微生物菌体制成生防菌剂进行推广使用过程中发现很多问题，作为微生物活体，其对外界因素比较敏感；药效较慢；产生抑菌物质是拮抗菌发挥生防效果的主要方面，但拮抗物质的产生受环境影响较大，这使得拮抗菌的田间应用效果往往不稳定。以微生物合成的抑菌物质为材料制成微生物农药可直接发挥其拮抗作用，所受限制和影响因素较少，并且在环境中易分解，安全环保，与环境相容性好。微生物分泌的抑菌物质是一种很好的微生物农药资源。脂肽抗生素是芽胞杆菌产生的一类重要抗生素，经非核糖体途径合成，由多个氨基酸组成的肽环连接一个C13-C18的β-氨基脂肪酸组成。脂肽抗生素具有广谱抗真菌活性，是芽胞杆菌发挥生防作用的主要因素。利用脂肽抗生素的广谱抗菌作用，对土壤中有害微生物存在广泛的抑制能力，保护植株体不受侵害。同时，脂肽抗生素具有较高的稳定性，耐酸、耐高温，对多种酶的作用不敏感，这就保证它在一段时间内能够很好的发挥拮抗效应。脂肽抗生素是芽胞杆菌产生的次级代谢物，一般是在发酵后期产生，通常受到培养基营养成分以及发酵条件的影响。通过优化发酵条件，可充分发挥菌株产次级代谢产物的潜力。目前枯草芽胞杆菌合成脂肽抗生素的最优发酵条件尚不清晰。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种响应面法优化枯草芽孢杆菌生产脂肽类抗生素的方法，其中所用的菌株为枯草芽胞杆菌Z-5菌株，该菌株于2014年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类学命名为Bacillussubtilis，保藏编号为CGMCCNO.8925，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。为达上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：一种响应面法优化枯草芽孢杆菌生产脂肽类抗生素的方法，包括如下步骤：(1)通过单因素试验确定培养Z-5菌株最佳的碳源、氮源、无机盐分别是玉米粉、黄豆饼粉、FeSO4·7H2O；(2)对玉米粉、黄豆饼粉和FeSO4·7H2O进行最陡爬坡试验，根据设计梯度进行试验，确定玉米粉、黄豆饼和FeSO4·7H2O的最佳浓度范围；(3)利用Design-Expert8.0.6软件设计Box-Behnken试验，并根据设计结果进行发酵培养，检测发酵上清抑菌带宽度，经软件分析抑菌带宽度得到回归方程为：Y＝–0.29741+0.40575A+0.14825B+49.3C+0.07875AB–1.75AC–1.75BC–0.058375A2–0.12338B2–521.25C2(R2＝0.9946；R2-adj＝0.9878)其中Y是抑菌带宽度预测值，单位为cm，A、B和C分别是玉米粉，黄豆饼粉和FeSO4·7H2O；(4)通过步骤(3)中建立的响应面模型，确定优化的玉米粉，黄豆饼粉和FeSO4·7H2O的最佳组合；(5)通过Plackett-Burman试验来确定该菌株培养条件，包括pH、温度、转速、装液量、接种量、接种时间中影响抑菌带宽度的关键因素，最终确定的关键因素为转速、接种量和pH；(6)对步骤(5)中确定的关键因素进行最陡爬坡试验，并设计响应面的关键因素的水平；(7)利用Design-Expert8.0.6软件设计培养条件优化响应面试验，经软件分析得到回归方程为：Y＝1.45+0.016A+0.025B+8.750E–003C+0.010AB–0.033AC–0.025BC–0.043A2–0.061B2–0.14C2(R2＝0.9930；R2-adj＝0.9839)其中Y是抑菌带宽度预测值，单位为cm，A、B和C分别是转速、接种量和pH；(8)通过步骤(7)建立的响应面模型，确定优化的转速、接种量和pH组合；(9)利用优化得到的条件进行发酵培养，在不同时间段取样，检测不同发酵时间上清液的抑菌带宽度，确定最佳的发酵时间；(10)利用最终得到的培养条件，包括培养基、PH值、接种量、转速、培养时间，进行该芽孢杆菌的发酵培养，并检测其上清液抑菌带宽度，与预测值进行比较，验证步骤(7)中优化模型的准确率。进一步的，所述步骤(2)中玉米粉、黄豆饼和FeSO4·7H2O的最佳浓度范围分别为3％～5％、0.5％～3.5％、0.01％～0.04％。进一步的，所述步骤(4)中玉米粉最佳值为3.85％，黄豆饼粉最佳值为1.57％，FeSO4·7H2O最佳值为0.03％。进一步的，所述步骤(8)中优化的转速、接种量和pH分别定为190r/min，8.5％和7.0。进一步的，所述步骤(9)中最佳的发酵时间为33h。进一步的，所述步骤(10)中最终的培养条件为玉米粉3.85％，黄豆饼粉1.57％，FeSO4·7H2O0.03％，初始pH7.0，接种量为8.5％，转速为190r/min，37℃培养33h。进一步的，培养基中还包括NaH2PO4·2H2O0.02％，Na2HPO4·2H2O0.04％。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：脂肽抗生素是芽胞杆菌产生的次级代谢物，一般在发酵后期产生，通常受到碳源、氮源、无机盐等培养基营养成分以及温度、发酵时间、接种量、通气量、pH值等发酵条件的影响。通过对发酵条件进行优化，可充分发挥菌株产生次级代谢产物的潜力，提高芽胞杆菌生产脂肽抗生素的能力，进而提高芽胞杆菌制剂防治植物真菌病害的能力，为提高微生物代谢产物类生物农药的生产效率及防治病害的效果奠定基础。附图说明图1为实施例1中枯草芽胞杆菌Z-5菌株发酵上清液HPLC分离结果图。图2a-2f为实施例1中枯草芽胞杆菌Z-5菌株发酵上清液HPLC分离组分的MALDI-TOFMS鉴定结果图。图3a为实施例3中玉米粉和黄豆饼粉交互影响结果图。图3b为实施例3中玉米粉和FeSO4·7H2O交互影响结果图。图3c为实施例3中黄豆饼粉和FeSO4·7H2O交互影响结果图。图4a为实施例5中转速和接种量交互影响结果图。图4b为实施例5中转速和pH交互影响结果图。图4c为实施例5中接种量和pH交互影响结果图。图5为实施例6中Z-5菌株发酵上清液抑菌活性随时间变化结果图。图6A为实施例7中未优化发酵条件Z-5菌株发酵上清液抑菌效果图，a为未优化发酵上清液。图6B为实施例7中只培养基优化后Z-5菌株发酵上清液抑菌效果图，b为培养基成分优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种响应面法优化枯草芽孢杆菌生产脂肽类抗生素的方法，所述枯草芽孢杆菌为Z-5菌株，该菌株于2014年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.8925，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)通过单因素试验确定培养Z-5菌株最佳的碳源、氮源、无机盐分别是玉米粉、黄豆饼粉、FeSO

【技术特征摘要】
1.一种响应面法优化枯草芽孢杆菌生产脂肽类抗生素的方法，所述枯草芽孢杆菌为Z-5菌株，该菌株于2014年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.8925，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过单因素试验确定培养Z-5菌株最佳的碳源、氮源、无机盐分别是玉米粉、黄豆饼粉、FeSO4·7H2O；
(2)对玉米粉、黄豆饼粉和FeSO4·7H2O进行最陡爬坡试验，根据设计梯度进行试验，确定玉米粉、黄豆饼和FeSO4·7H2O的最佳浓度范围；
(3)利用Design-Expert8.0.6软件设计Box-Behnken试验，并根据设计结果进行发酵培养，检测发酵上清抑菌带宽度，经软件分析抑菌带宽度得到回归方程为：
Y＝–0.29741+0.40575A+0.14825B+49.3C+0.07875AB–1.75AC–1.75BC–0.058375A2–0.12338B2–521.25C2(R2＝0.9946；R2-adj＝0.9878)
其中Y是抑菌带宽度预测值，单位为cm，A、B和C分别是玉米粉，黄豆饼粉和FeSO4·7H2O；
(4)通过步骤(3)中建立的响应面模型，确定优化的玉米粉，黄豆饼粉和FeSO4·7H2O的最佳组合；
(5)通过Plackett-Burman试验来确定该菌株培养条件，包括pH、温度、转速、装液量、接种量、接种时间中影响抑菌带宽度的关键因素，最终确定的关键因素为转速、接种量和pH；
(6)对步骤(5)中确定的关键因素进行最陡爬坡试验，并设计响应面的关键因素的水平；
(7)利用Design-Expert8.0.6软件设计培养条件优化响应面试验，经软件分析得到回归方程为：
Y＝1.45+0.016A+0.025B+8.750E–003C+0.010AB–0.033AC–0.025BC–0.043A2–0.061B2–0.14C2(R2＝0.9930；R2-adj＝...

【专利技术属性】
技术研发人员：张冬冬，陈晓萌，张学超，朱宝成，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13