高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗SARS‑CoV‑2的全人源单克隆抗体，所述抗体通过流式分选‑单细胞PCR技术筛选获得，具有独特的CDR分区，本发明专利技术还公开了所述抗体在制备2019‑冠状病毒病治疗药物中的应用。本发明专利技术公开的单克隆抗体具有高效、特异的抗SARS‑COV‑2病毒活性，还具有高表达、全人源、稳定性好的特点，适合产业化生产。

All human monoclonal antibody against sars-cov-2 and its application

【技术实现步骤摘要】
高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用
本专利技术公开了一种抗体，属于微生物学和免疫学领域。
技术介绍
COVID-19的病原体是SARS-CoV-2，也被称为2019-冠状病毒。SARS-CoV-2属冠状病毒科(Coro-naviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，是一类有包膜的单股正链RNA病毒。基因组全长为30kb，依次由5＇-端非编码区、非结构蛋白开放阅读框(ORF)1a/b编码区、刺突糖蛋白S编码区、包膜蛋白E编码区、膜蛋白M蛋白编码区、核衣壳蛋白N蛋白编码区及3＇-端非编码区组成。其中，非结构蛋白ORF1a/b区编码的聚蛋白可被切割，形成RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)等，指导病毒基因组复制、转录和翻译。结构蛋白S可特异性地与宿主细胞的受体结合，是病毒入侵宿主易感细胞的关键蛋白。M蛋白和E蛋白参与病毒包膜的形成，而N蛋白则参与病毒的装配。病毒侵染宿主细胞的过程需要宿主细胞膜表面受体的参与。不同冠状病毒可利用不同的细胞受体来完成入侵，如SARS-CoV的受体是血管紧张素转化酶2(ACE2)，而MERS-CoV的受体是氨基肽酶4(DPP4，也称CD26)。研究证明，氨肽酶N不是SARS-CoV-2的受体，而ACE2可作为其受体。目前已知引起人致病的冠状病毒包括7种，其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1致病性较低，一般引起轻微的呼吸道症状。基因测序结果显示，SARS-CoV-2与SARS-CoV的同源性约79％,与MERS-CoV的同源性约50％。文献报道，新型冠状病毒S蛋白ACE2亲和力较SARS-COV强，提示具有更强的传染性。到目前为止，还没有专门用于预防的疫苗和治疗冠状病毒的特效药物。一般采用非特异性治疗，预防严重的并发症，降低重症发病率和死亡率，提高治愈率。研发新型冠状病毒病的疫苗和特异治疗药物成为全球应急科研攻关的重要任务。SARS-CoV-2感染恢复者体内存在抗病毒多克隆抗体，可中和病毒并阻止新一轮的感染，血浆可用于重症治疗。不足之处：献浆来源有限，难以大规模制备，批间差异等；是否存在抗体依赖的增强作用(ADE效应)还有争议。相比血浆，单克隆抗体(mAb)为单一B淋巴细胞分泌，成分单一明确，可规模化制备，副作用小，且已成功用于治疗多种传染性疾病。中和mAb可以通过杂交瘤技术，人源化转基因小鼠，噬菌体文库筛选以及单细胞技术制备。单细胞-PCR技术特点：全人源，天然稳定性好；需要获取恢复者外周血、特殊分选设备、后续克隆和筛选技术要求高，需要高通量。单细胞PCR技术的原理是新型冠状病毒感染恢复者体内存在对抗病毒的保护性单克隆抗体，编码抗体的基因位于人体外周血单个淋巴细胞内，通过流式细胞仪分选和单细胞-PCR技术可以“钓取”此基因。然后通过基因工程手段，体外规模化制备此分子。在细胞感染模型、动物感染模型上验证单克隆抗体的有效性，在非人灵长类动物体内评价其安全性。本专利技术拟采用单细胞PCR技术从SARS-CoV-2感染者恢复后的外周血中获得具有优异中和活性的单抗，目的是提供针对COVID-19具有良好保护效果的全人源单克隆治疗性抗体。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术通过流式分选-单细胞PCR技术筛选到了一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:1第26-33、51-58、97-117位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:5第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列所示。所述单克隆抗体在本申请中被命名为“4A8”。在一个优选的实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。在一个更为优选的实施方案中，所述抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:7或SEQIDNO:9所示。第二，本专利技术还提供了一种编码上述单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列由SEQIDNO:2所示，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列由SEQIDNO:6所示。在一个优选的实施方案中，编码所述抗体的重链恒定区的多核苷酸序列由SEQIDNO:4所示，编码所述抗体的轻链恒定区的多核苷酸序列由SEQIDNO:8或者SEQIDNO:10所示。第三，本专利技术还提供了一种表达上述编码单克隆抗体重链和/或轻链的多核苷酸的功能元件，这种功能元件可以是传统的表达载体。在一个优选的实施方案中，所述功能元件为线性表达框。在另一个优选的实施方案中，所述功能元件为哺乳动物表达载体。第四，本专利技术还提供了一种含有上述线性表达框的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，所述细胞为Expi293F细胞。在另一个优选的实施方案中，所述细胞为CHO-S细胞，本专利技术可以使用CHO-S细胞构建稳转工程细胞株，实现产业化生产。最后，本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备COVID-19治疗药物中的应用。本专利技术提供的单克隆抗体显示出对SARS-COV-2感染细胞良好的中和保护效果。本专利技术的结果显示，所述抗体在制备COVID-19治疗药物中具有广泛应用的前景。本专利技术公开的单克隆抗体还具有以下的技术优势:(1)全人源，在临床应用上，不需要进行人源化改造以降低人抗鼠抗体反应(HAMA反应)，即低免疫原性。(2)高亲和活性和高中和活性，单抗与S抗原的亲和常数KD是1.0nM,在SARS-COV-2感染的细胞模型上，半数有效浓度EC50是4nM。(3)靶向非受体结合区域：单抗能够与S蛋白和S1区特异结合，但不与RBD特异结合，提示单抗的识别区域为S1非RBD区，可以与靶向RBD或者S2的人源单抗联合应用，制备“鸡尾酒”疗法，避免耐药毒株的产生和提高疗效。(4)稳定性好因为单抗基因来自人体的同一个细胞，是天然配对的，已知人体内IgG1抗体的半衰期是21～28天，理论上公开的单抗具有一致的人体内半衰期。附图说明图1.流式细胞仪单细胞分选图；图2.单克隆抗体可变区基因扩增和T载体上的酶切结果鉴定图谱；图3.单克隆抗体重链和轻链线性表达框的核酸电泳鉴定图谱；图4.单克隆抗体可变区序列的检索结果输出图；图5.单克隆抗体重链和轻链表达载体的核酸电泳检测酶切鉴定图谱；图6.亲和层析纯化后的单抗SDS-PAGE检测图谱；图7.ELISA检测不同单抗与S蛋白的结合活性随浓度变化的曲线图；图8.ELISA检测纯化单抗与S蛋白、S1蛋白、S2蛋白、RBD蛋白的结合活性随浓度变化的曲线图；图9.单抗在细胞模型上的IC50测定曲线图；图10.Fortibio测定与S蛋白的亲和力结果输出图。具体实施方式下面结合具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗SARS-CoV-2的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1第26-33、51-58、97-117位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗SARS-CoV-2的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:1第26-33、51-58、97-117位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:5第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列所示。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。


3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:7或SEQIDNO:9所示。


4.一种编码权利要求1-3任一所述单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列由SEQIDNO:2所示，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列由SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，李建民，迟象阳，张军，付玲，于长明，徐俊杰，侯利华，张冠英，范鹏飞，郝勐，董韵竹，宋小红，陈旖，张金龙，房婷，刘树玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11