一种抗狂犬病病毒单克隆抗体、制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及医学生物抗体技术领域，提供了一种抗狂犬病病毒单克隆抗体、制备方法及用途。该单克隆抗体的轻链可变结构域包含高变区CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；重链可变结构域包含高变区CDR1＇、CDR2＇、CDR3＇，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示。经检测，该单克隆抗体具有高体外中和活性、高中和指数，抗原表位靠近狂犬病病毒糖蛋白中和II表位或与位于中和II表位内，其针对的关键氨基酸位点一个为aa205，另一个由37、194和204位氨基酸共同构成，对街毒株有很好的中和能力；此外，其Tm值为70.58℃，具有较好的热稳定性，提示有可能作为抗狂犬病病毒被动免疫制剂产品或开发体外诊断试剂盒。

A monoclonal antibody against rabies virus, its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种抗狂犬病病毒单克隆抗体、制备方法及用途
本专利技术涉及医学生物抗体
，涉及一株具有较高体外抗狂犬病病毒活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其制备方法及其在检测和中和狂犬病病毒方面的用途。
技术介绍
狂犬病毒(Rabiesvirus,RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)、狂犬病毒属(Lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA，为RNA病毒，是引起狂犬病的病原体。狂犬病毒主要分为7个基因型，编码5种结构蛋白，其中糖蛋白(Glycoprotein，G)为跨膜蛋白，构成病毒表面的突起，是主要保护性抗原，可以诱导保护性抗体产生。狂犬病病毒疫苗是预防狂犬病最有效的手段，但对于III级以上暴露，单独使用狂犬病病毒疫苗可能导致免疫失败，需要与被动免疫制剂一同使用。抗狂犬病病毒被动免疫制剂包括抗狂犬病人免疫球蛋白和马抗狂犬病病毒血清，二者均能产生有效的保护。但抗狂犬病人免疫球蛋白价格昂贵且存在伦理问题，马抗狂犬病病毒血清则存在血清病的风险，在一定程度上限制了上述产品的使用。因此需要研发新一代的抗狂犬病病毒被动免疫制剂，而抗狂犬病病毒单克隆抗体被认为是上述产品最有可能的替代品。
技术实现思路
本专利技术是为解决上述技术问题而进行的，其目的在于提供一种新型的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其关键氨基酸位点在街毒株中突变率较低，具有较高的体外抗狂犬病病毒活性，对狂犬病病毒CVS-11和CTN株中和指数较高。本专利技术的另一目的在于提供该单克隆抗体在狂犬病重组被动免疫制剂产品或诊断试剂开发中的用途。本专利技术的第三目的在于提供该单克隆抗体的制备方法。本专利技术的第一方面在于，提供了一种抗狂犬病病毒单克隆抗体(编号为R42抗体)，具有：轻链可变结构域，包含高变区CDR1、CDR2、CDR3；重链可变结构域，包含高变区CDR1＇、CDR2＇、CDR3＇，其中，CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：Ala-Ser-Asn-Ile-Arg-Ser-Ser-Thr；CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：Gly-Asp-His；CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示：Ala-Val-Trp-Asp-Asp-His-Leu-Asn-Ile-Val-Leu；CDR1＇的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示：Gly-Ala-Ser-Thr-Asn-Ser-Tyr-Tyr；CDR2＇的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示：Met-Asn-Tyr-Arg-Gly-Thr-Pro；CDR3＇的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示：Ala-Arg-Val-Asp-Asn-Trp-Asn-Phe-Asp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile。在具体形式上，该单克隆抗体选自包含有轻链可变结构域高变区和重链可变结构域高变区的片段、包含有轻链可变结构域和重链可变结构域的片段、或具有全长重链和轻链的完整抗体分子。经检测，该单克隆抗体具有抗狂犬病病毒体外中和活性，比活为691IU/mg；该抗体对狂犬病病毒CVS-11和CTN株的中和指数分别为8.52和7.05；对该抗体的逃逸株糖蛋白测序分析表明，抗体针对狂犬病病毒糖蛋白37、194、204和205位氨基酸，其中，aa205位是主要突变位点，存在于所有突变株中；37、194和204位氨基酸是次要突变位点。除37位氨基酸位于IIb表位外，其他关键氨基酸均不在传统糖的蛋白中和表位内。与包括全部7种基因亚型的1338株狂犬病病毒街毒株糖蛋白基因比对表明，纳入分析的1338株街毒株在上述位点仅有一个街毒株的194位氨基酸突变类型与逃逸突变株相同。本专利技术的第二方面，提供了一种表达载体，该表达载体承载有上述抗狂犬病病毒单克隆抗体或编码其的核苷酸序列。编码该单克隆抗体轻链可变结构域的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，编码重链可变结构域的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。扩增轻链可变结构域的上下游引物序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示，扩增重链可变结构域的上下游引物序列分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。本专利技术的第三方面，提供了抗狂犬病病毒单克隆抗体的用途，第一用途为在制备预防或治疗狂犬病药物中的用途，优选为制备狂犬病重组被动免疫制剂产品；第二用途为在在制备狂犬病毒检测试剂或检测试剂盒中的用途。针对在制备预防或治疗狂犬病药物中的用途，本专利技术的第四方面提供了一种抗狂犬病病毒被动免疫制剂，包括活性成分以及药学上可接受的药物载体，所述活性成分包括抗狂犬病病毒单克隆抗体、编码该单克隆抗体的核苷酸或运载有所述抗狂犬病病毒单克隆抗体或所述核苷酸的载体。针对狂犬病毒检测试剂或检测试剂盒中的用途，检测试剂中包括经生物标记或化学标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体；检测试剂盒中包括血液样本处理试剂以及抗狂犬病病毒单克隆抗体经生物标记或化学标记得到的标记复合物。本专利技术的第五方面，提供了单克隆抗体的制备方法，简言之，从抗狂犬病病毒噬菌体库中筛选获得的一个阳性克隆，并扩增获得其抗体轻、重链可变结构域，构建全分子抗体的瞬时表达质粒后在HEK293EBNA1细胞中瞬时表达，亲和纯化后对该单克隆抗体进行性质分析。本专利技术的有益保障及效果如下：本专利技术的单克隆抗体具有高体外中和活性、高中和指数，抗原表位靠近狂犬病病毒糖蛋白中和II表位或与位于中和II表位内。该抗体针对的关键氨基酸位点有两个，一个为aa205，另一个由37、194和204位氨基酸共同构成。对街毒株的分析表明，4个氨基酸位点均不是高保守位点，但抗体逃逸株的氨基酸类型基本不存在与街毒株中，仅194位氨基酸突变为Lys在街毒株中有出现，出现率为0.07％；其他三个位点均未出现与逃逸株相同的氨基酸。考虑到病毒逃逸该株抗体的中和需要205位氨基酸突变，且37、194和204位至少一个位点突变，推测该抗体对街毒株有很好的中和能力。此外，抗体的Tm值对的工程细胞株构建具有重要指导意义。抗体的Tm值越高其稳定性越好、越容易在真核表达中获得更高的表达量。本专利技术筛选得到的单克隆抗体Tm值为70.58℃，具有较好的热稳定性，有利于提高表达量和维持产品的稳定性。综上所述，该抗体具有较高体外中和活性、低病毒逃逸率、较高的Tm值，有可能作为一种抗狂犬病病毒被动免疫制剂产品或开发体外诊断试剂盒。附图说明图1为R42单克隆抗体非还原CE-SDS纯度测试结果；图2为R42单克隆抗体溶解温度测试结果；图3为R42单克隆抗体中和指数测定结果；图4为逃逸株中发生改变的氨基酸位点；图5为狂犬病病毒糖蛋白抗原表位和R42抗体逃逸病毒突变位点。具体实施方式现结合实施例和附图，对本专利技术作详细描述，但本专利技术的实施不仅限于此。本专利技术所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗狂犬病病毒单克隆抗体，其特征在于，具有：/n轻链可变结构域，包含高变区CDR1、CDR2、CDR3；以及/n重链可变结构域，包含高变区CDR1＇、CDR 2＇、CDR 3＇，/n其中，所述CDR1的氨基酸序列为：Ala-Ser-Asn-Ile-Arg-Ser-Ser-Thr；/n所述CDR2的氨基酸序列为：Gly-Asp-His；/n所述CDR3的氨基酸序列为：Ala-Val-Trp-Asp-Asp-His-Leu-Asn-Ile-Val-Leu；/n所述CDR 1＇的氨基酸序列为：Gly-Ala-Ser-Thr-Asn-Ser-Tyr-Tyr；/n所述CDR 2＇的氨基酸序列为：Met-Asn-Tyr-Arg-Gly-Thr-Pro；/n所述CDR 3＇的氨基酸序列为：Ala-Arg-Val-Asp-Asn-Trp-Asn-Phe-Asp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗狂犬病病毒单克隆抗体，其特征在于，具有：
轻链可变结构域，包含高变区CDR1、CDR2、CDR3；以及
重链可变结构域，包含高变区CDR1＇、CDR2＇、CDR3＇，
其中，所述CDR1的氨基酸序列为：Ala-Ser-Asn-Ile-Arg-Ser-Ser-Thr；
所述CDR2的氨基酸序列为：Gly-Asp-His；
所述CDR3的氨基酸序列为：Ala-Val-Trp-Asp-Asp-His-Leu-Asn-Ile-Val-Leu；
所述CDR1＇的氨基酸序列为：Gly-Ala-Ser-Thr-Asn-Ser-Tyr-Tyr；
所述CDR2＇的氨基酸序列为：Met-Asn-Tyr-Arg-Gly-Thr-Pro；
所述CDR3＇的氨基酸序列为：Ala-Arg-Val-Asp-Asn-Trp-Asn-Phe-Asp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile。


2.根据权利要求1所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其特征在于：
其中，该单克隆抗体选自包含有轻链可变结构域高变区和重链可变结构域高变区的片段、包含有轻链可变结构域和重链可变结构域的片段、或具有全长重链和轻链的完整抗体分子。


3.根据权利要求1所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其特征在于：
编码该单克隆抗体轻链可变结构域的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，编码重链可变结构域的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，
扩增轻链可变结构域的上下游引物序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示，扩增重链可变结构域的上下游引物序列分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。


4.一种表达载体，其特征在于，该表达载体承载有权利要求1～3任一项所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体或编码其的核苷酸序列。


5.权利要求1所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体在制备预防或治疗狂犬病药物中的用途。

【专利技术属性】
技术研发人员：毛晓燕，陈继军，安晨，赵晓瑞，叶星，
申请(专利权)人：兰州生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62