本发明专利技术公开了一种人SARS‑CoV‑2单克隆抗体，其制备方法为：以SARS‑CoV Nucleocapsid重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，进行小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合及亚克隆，再经商品化的产品SARS‑CoV‑2 Nucleocapsid及MERS Nucleocapsid进行大量反复筛选以及细胞株的驯化，最终成功获得可分泌高亲和力、高特异性抗SARS‑CoV‑2 N单克隆抗体杂交瘤细胞株，最后腹水制备及纯化，获得单克隆抗体；SARS‑CoV Nucleocapsid重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还公开了该单克隆抗体在制备SARS‑CoV‑2病毒检测产品中的应用，在制备抑制SARS‑CoV‑2病毒的药物中的应用。本发明专利技术的单克隆抗体可通过双抗体夹心法对人体咽拭子/肺部分泌物等样本中SARS‑CoV‑2进行检测，可应用于SARS‑CoV‑2检测试剂盒，适用于SARS‑CoV‑2病毒感染的诊断、防控，病毒的科学研究等。
A monoclonal antibody against sars-cov-2 and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用，属于单克隆抗体制备
技术介绍
2019年12月以来，中国湖北省武汉市发现多起不明原因肺炎病例，并在短时间内迅速蔓延。2020年1月9日，科学家在电子显微镜下，观察到引起此次肺炎的病原体呈现有包膜的、具有类似日冕外形的典型冠状病毒形态。同时病原基因组测序结果显示，其核酸序列与此前发现的6种冠状病毒(如SARS、MERS等)并非完全一致。因此2020年1月12日，世界卫生组织(WHO)将该新病毒命名为：2019新型冠状病毒(2019NovelCoronavirus，2019-nCoV)，2月11日，国际病毒分类委员会(ICTV)将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2。该病毒潜伏期长，传染性强，截至2020年2月18日24时，已有确诊病例74185例(其中重症病例11977例)，累计治愈出院病例14376例，累计死亡病例2004例，有疑似病例5248例。累计追踪到密切接触者574418人，尚在医学观察的密切接触者135881人(信息来自国家卫生健康委员会官方网站)。全球已有25个国家和地区有确诊病例(世界卫生组织2020年2月10日)，已构成国际关注的突发公共卫生事件。目前尚无特效针对性药物治疗，因此针对健康人群的预防，疑似及确诊病例的诊断，隔离，治疗工作至关重要。冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，是目前人类已知的RNA病毒中基因组最大的病毒，其长度为27至32kb。冠状病毒有至少4个主要结构蛋白，包括刺突蛋白(S)，膜蛋白(M)，包膜蛋白(E)和核衣壳(N)蛋白，这些蛋白对于病毒与细胞受体结合至关重要，都是构成病毒完成结构所必需的。其中核衣壳蛋白(N)是一种碱性磷蛋白,其中央区与病毒基因组RNA结合,形成卷曲的核衣壳螺旋，是包裏病毒遗传物质的核心结构，在感染细胞中，是表达量最高的病毒蛋白之一。目前对于病毒感染的实验室诊断，一般包括3种方法：以PCR技术为基础的分子诊断；以免疫学为基础的血清学检测；以体外病毒培养为基础的病原生物学诊断。由于体外病毒培养对于试验条件以及操作人员技术要求都很高，一般不作为常规诊断方法。随着近几年基因测序技术的不断革新，此次新冠肺炎疫情发生初期，科学家们就完成了病毒的基因组测序，随后多家核酸检测试剂盒就相继问世，并很快投入使用。目前新冠病毒疑似病例的实验室检测多用核酸检测(PCR)，但是核酸检测的样本多为上呼吸道样本(咽拭子、痰液为主)，采集过程对医护人员暴露风险极大。且实验过程较长，约4～5h，容易发生污染(即造成假阳或假阴结果)。而且由于病毒变异频繁、引物设计等原因，核酸检测方法在实际应用过程中也暴露出假阴性高、不同厂家检测结果符合率低等诸多问题。而以病毒抗原检测的诊断方法能够大大降低此风险，因为其一般采用血清作为检测样本，样本采集便捷且含毒量低，同时省去样本在实验室的复杂处理程序，15～20min即可得到检测结果，操作简单，在保护医护人员的同时也能极大缓解当前巨大的临床诊疗压力。SARS-CoV-2病毒抗原检测试剂盒开发的关键是找到其高特异性、高亲和力的抗体。由于单克隆抗体相比多克隆抗体，具有高度特异性的优势，可以大大提高所构建试剂盒的检测特异性和抗干扰能力。另外由于病毒包膜上的蛋白很容易发生变异，而N蛋白却相对稳定，是病毒主要的抗原部分，其抗原性较其他蛋白强。且目前还未见商品化的以SARS-CoV-2N蛋白单克隆抗体为核心原料的诊断试剂盒。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种人SARS-CoV-2单克隆抗体，及其制备方法和应用。本专利技术利用DNA重组技术，合成了SARS-CoVNucleocapsid全长基因，构建至原核表达载体pET28a中，通过优化发酵、纯化及复性工艺，体外获得了大量SARS-CoVNucleocapsid蛋白；通过免疫BALB/c雌性小鼠，通过杂交瘤技术成功制备抗人SARS-CoVNucleocapsid单克隆抗体；再经商品化的产品SARS-CoV-2Nucleocapsid及MERSNucleocapsid进行大量反复筛选以及细胞株的驯化，最终成功获得高亲和力、高特异性抗SARS-CoV-2N单克隆抗体；并以此为基础开发便捷、快速的SARS-CoV-2诊断方法及其诊断试剂，为临床诊断SARS-CoV-2感染提供一种快速、准确的方法，同时也为新病毒的科学研究提供有力支持。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种人SARS-CoV-2单克隆抗体，是以SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白为免疫原，免疫小鼠得到的单克隆抗体；所述SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白是通过以下方法制备得到的：将人SARS-CoVNucleocapsid基因(核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)插入表达载体pET28a，构建pET28a-SARS-CoV-N融合表达质粒，转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导，纯化、复性得到SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白。SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO.1)：MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADSTQA人SARS-CoVNucleocapsid基因的核苷酸序列(SEQIDNO.2)：atgtctgataatggaccccaatcaaaccaacgtagtgccccccgcattacatttggtggacccacagattcaactgacaataaccagaatggaggacgcaatggggcaaggccaaaacagcgccgaccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcacagctctcactcagcatggcaaggaggaacttagattccctcgaggccagggc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人SARS-CoV-2单克隆抗体，其特征在于：是以SARS-CoV Nucleocapsid重组蛋白为免疫原，免疫小鼠得到的单克隆抗体；所述SARS-CoV Nucleocapsid重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种人SARS-CoV-2单克隆抗体，其特征在于：是以SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白为免疫原，免疫小鼠得到的单克隆抗体；所述SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的人SARS-CoV-2单克隆抗体，其特征在于：所述SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白是通过以下方法制备得到的：将核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的人SARS-CoVNucleocapsid基因插入表达载体pET28a，构建pET28a-SARS-CoV-N融合表达质粒，转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导，纯化、复性得到SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白。
3.权利要求1或2所述的人SARS-CoV-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于：以SARS-CoVNucleocapsid重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，再进行小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合及亚克隆，并经SARS-CoV-2Nucleocapsid及MERSNucleocapsid特异性筛选及驯化，最终获得特异性好、效价高的单克隆细胞株，然后进行腹水制备及纯化，获得大量抗人SARS-CoVNucleocapsid的单克隆抗体。
【专利技术属性】
技术研发人员：赵风强，秦李娜，吴炬，王咚咚，董兵，张凤英，邬晓乐，
申请(专利权)人：北京博奥森生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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