针对甲型肝炎病毒的单域抗体的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术或免疫学技术领域，涉及针对甲型肝炎病毒的单域抗体的应用。所述的单域抗体的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:83‑ SEQ ID NO:117中的任意一条所示；所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:118‑SEQ ID NO:143中的任意一条所示；所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:144‑SEQ ID NO:174中的任意一条所示。本发明专利技术的有益效果是：传统通过检测甲肝病毒抗体（HAV‑IgM,HAV‑IgG）用于甲肝病毒抗原（HAV‑Ag）的间接检测的方法，其检测步骤多，影响因素也多。本发明专利技术提供了一种基于ELISA不需要通过RT‑PCR的直接检测甲肝病毒抗原（HAV‑Ag）的检测方法。

Application of single domain antibody against hepatitis A virus

【技术实现步骤摘要】
针对甲型肝炎病毒的单域抗体的应用
本专利技术涉及生物技术或免疫学
，涉及针对甲型肝炎病毒的单域抗体的应用。
技术介绍
抗体(Antibody,Ab)即免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是血液和组织液中的一类糖蛋白，由B细胞接收抗原刺激后增殖分化生成的浆细胞产生，主要存在与血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，是介导体液免疫的重要效应分子。抗体除了因其作为重要效应分子介导特异性体液免疫应答外，抗体在疾病的防治特别是感染性疾病的防治方面扮演者重要角色，Behring创立血清疗法因此获得医学与生理学诺贝尔奖。此后，以多克隆、单克隆及基因工程抗体技术人工制备的抗体逐步应用于临床。仅2011年抗药药物就以480亿美元的销售额领跑全球药品市场，占整个生物制药市场的34.4％。至2017年，美国FDA和欧盟EMA批准的治疗性抗体药物有76个，主要用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗。抗体作为可以特异性识别某一个蛋白(抗原)的分子，除了在疾病预防和治疗方面的作用强大之外，其作为检测工具在检验、科学研究方面的用途也不言而喻。酶联免疫吸附实验(ELISA)正是利用抗体/抗原结合以实现检测目的一个重要方法。目前常用的ELISA检测方法有直接法、间接法、竞争法等，其基本原理均为抗原抗体结合反应。以此方法为基础ELISA试剂盒在检验检疫等场合的用途也十分广泛。部分检验检疫方法对于抗体的亲和力和稳定性要求非常苛刻，这就要求所使用的抗体在与其特异性结合的抗原亲和力要非常高，稳定性要非常好，并且这些抗体的使用和储存环境要更为广泛才更有利于检测方法的推广。传统单抗在抗原亲和力方面表现良好，并且虽然现在可以通过添加保护剂或改变缓冲液的方法提升其稳定性，但是其储存条件要求依然相对苛刻，一般应在低温运输或保存。而单域抗体在亲和力和稳定性方面就表现的更为优秀，单域抗体在未进行亲和力成熟之前，其与抗原的亲和力可达到pM级别，并且其室温稳定性良好，可以降低运输和储存成本。此外，单域抗体可以在原核表达系统中可以大量可溶性表达，降低生产成本，并且提高抗体批件稳定性。甲型病毒性肝炎简称甲肝，是一种由甲型肝炎病毒(HAV)感染引起的以肝脏炎症病变为主的传染病。1974年Feinstone等通过免疫电镜技术在甲肝患者粪便中发现甲肝病毒(HAV)。甲肝病毒是直径为27～32nm的小RNA病毒，其结构含有VP1～VP4四种多肽，基因组为单股正链RNA，约7500个核苷酸。HAV的传播途径为粪－口途径，主要在发展中国家流行。我国是甲肝的高流行国家。提高人群的免疫水平是预防甲肝的主要措施，随着甲肝灭活疫苗应用覆盖面不断扩大，甲肝的暴发流行得到有效的控制。因其临床表现与其他肝炎相似，因此甲肝的实验室诊断结果就显得尤为重要。在甲肝急性期患者血清中可以查出抗HAV-IgM及IgG，患者患病后2周抗HAV-IgM阳性率为100％，持续2～3周，然后迅速下降。因此，检测抗HAV-IgM可作为急性期的诊断指标。抗HAV-IgG是甲肝的主要中和抗体，一般可从病人血清中查出，此种抗体存在于患者体内很长时间甚至终身。甲肝的实验室诊断方法主要有RT-PCR法、RT-PCR-ELISA法、间接ELISA法、SPA协同凝集试验等。RT-PCR法灵敏度高，特异性强。但需专门的仪器设备，操作过程复杂，且对RNA的提取过程要求较严格；RT-PCR-ELISA法先通过RT-PCR扩增甲肝病毒RNA，再用ELISA法检测扩增产物。在保证了特异性的同时，也提高了检测的灵敏度。但是试验必须建立在RT-PCR的基础上，检测成本高；SPA协同凝集试验利用金黄色葡萄球菌细胞壁中的A蛋白(SPA)能特异性的与HAV-IgG的Fc段结合，当待检样本中含有HAV-Ag时，即出现反向间接凝集反应。该试验灵敏度和特异性较低，结果判断人为影响因素大，仅可作为设备受限时的初步检测方法；一般的ELISA法利用固相载体有吸附免疫活性蛋白的特性，在已包被抗人μ链的酶标板中，加入HAV抗体待检血清，若待检血清为甲肝感染急性期，则血清中的IgM抗体被其抗体人μ链抗体捕获，再加入酶标抗体，底物显色后，判断待检血清者为甲肝感染患者。但该方法只能检测已感染甲肝病毒的患者血清的IgM抗体，不能直接定量或半定量患者体内甲肝病毒；所以直接用甲肝病毒抗体检测待检样品中甲肝病毒含量可以更直接、准确的反映患者血清内或者其他样品中的甲肝病毒含量，但目前市面上直接检测甲肝病毒的定量或半定量ELISA试剂盒产品很少，并且已有的直接检测试剂盒的捕获抗体选择的是兔源多克隆抗体，由于兔多抗的制备批间差异很大，导致抗体的亲和力差异很大，这就造成了试剂盒检测的生产批间稳定性很差，重复性不好。所以选择生产工艺稳定并且亲和力更高的甲肝病毒抗体是准确检测样本甲肝病毒含量的重点。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术的目的是提供特异性针对甲型肝炎病毒的单域抗体并建立基于抗甲型肝炎病毒单域抗体的应用，首先，在获得高特异性的单域抗体后通过原核表达或者酵母表达便可以获得，产量和纯化效率高并且批间质量稳定，其次，单域抗体的亲和力比传统抗体有一定优势，可以提升抗原捕获能力和检测效果，提高检测的灵敏度，此外，单域抗体属于单克隆抗体，这就能保证检测试剂的单一性和可控性，更好的控制检测试剂盒的检测标准。单域抗体作为单克隆抗体的一类，其比传统单抗的亲和力普遍更高，稳定性更好，并且它也具备传统单抗的优点。因此，本专利技术就是利用上述优势，获得针对甲型肝炎病毒的抗体，这些获得的抗体既能够在普通的ELISA实验中作为检测工具对各类样品中的甲型肝炎病毒进行定性分析，也可以被开发成ELISA检测试剂盒，对人群中的甲型肝炎病毒进行定量分析，用于甲肝的临床诊断。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：针对甲型肝炎病毒的单域抗体在制备甲型肝炎诊断试剂或甲型肝炎病毒检测试剂中的应用,其特征在于，所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；所述的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO:83-SEQIDNO:117中的任意一条所示；所述的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO:118-SEQIDNO:143中的任意一条所示；所述的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO:144-SEQIDNO:174中的任意一条所示。上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。针对甲型肝炎病毒的单域抗体,所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；所述的单域抗体的互补决定区CDR的序列为下述(1)-(39)中的一种：(1)SEQIDNO:83所示的CDR1，SEQIDNO:118所示的CDR2，SEQIDNO:144所示的CDR3(对应于抗体1A2、1B4)；(2)SEQIDNO:84所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 针对甲型肝炎病毒的单域抗体在制备甲型肝炎诊断试剂或甲型肝炎病毒检测试剂中的应用，其特征在于，所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；所述的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:83- SEQ IDNO:117中的任意一条所示；所述的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:118-SEQ ID NO:143中的任意一条所示；所述的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:144-SEQ ID NO:174中的任意一条所示。/n

【技术特征摘要】
1.针对甲型肝炎病毒的单域抗体在制备甲型肝炎诊断试剂或甲型肝炎病毒检测试剂中的应用，其特征在于，所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；所述的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO:83-SEQIDNO:117中的任意一条所示；所述的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO:118-SEQIDNO:143中的任意一条所示；所述的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO:144-SEQIDNO:174中的任意一条所示。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；所述的单域抗体的互补决定区CDR的序列为下述（1）-（39）中的一种：
（1）SEQIDNO:83所示的CDR1，SEQIDNO:118所示的CDR2，SEQIDNO:144所示的CDR3；
（2）SEQIDNO:84所示的CDR1，SEQIDNO:119所示的CDR2，SEQIDNO:145所示的CDR3；
（3）SEQIDNO:84所示的CDR1，SEQIDNO:119所示的CDR2，SEQIDNO:156所示的CDR3；
（4）SEQIDNO:84所示的CDR1，SEQIDNO:119所示的CDR2，SEQIDNO:169所示的CDR3；
（5）SEQIDNO:85所示的CDR1，SEQIDNO:120所示的CDR2，SEQIDNO:146所示的CDR3；
（6）SEQIDNO:86所示的CDR1，SEQIDNO:121所示的CDR2，SEQIDNO:147所示的CDR3；
（7）SEQIDNO:87所示的CDR1，SEQIDNO:122所示的CDR2，SEQIDNO:148所示的CDR3；
（8）SEQIDNO:88所示的CDR1，SEQIDNO:123所示的CDR2，SEQIDNO:149所示的CDR3；
（9）SEQIDNO:89所示的CDR1，SEQIDNO:124所示的CDR2，SEQIDNO:150所示的CDR3；
（10）SEQIDNO:90所示的CDR1，SEQIDNO:124所示的CDR2，SEQIDNO:150所示的CDR3；
（11）SEQIDNO:91所示的CDR1，SEQIDNO:125所示的CDR2，SEQIDNO:151所示的CDR3；
（12）SEQIDNO:92所示的CDR1，SEQIDNO:126所示的CDR2，SEQIDNO:152所示的CDR3；
（13）SEQIDNO:92所示的CDR1，SEQIDNO:126所示的CDR2，SEQIDNO:153所示的CDR3；
（14）SEQIDNO:92所示的CDR1，SEQIDNO:126所示的CDR2，SEQIDNO:173所示的CDR3；
（15）SEQIDNO:93所示的CDR1，SEQIDNO:126所示的CDR2，SEQIDNO:152所示的CDR3；
（16）SEQIDNO:94所示的CDR1，SEQIDNO:127所示的CDR2，SEQIDNO:154所示的CDR3；
（17）SEQIDNO:95所示的CDR1，SEQIDNO:128所示的CDR2，SEQIDNO:155所示的CDR3；
（18）SEQIDNO:96所示的CDR1，SEQIDNO:129所示的CDR2，SEQIDNO:156所示的CDR3；
（19）SEQIDNO:97所示的CDR1，SEQIDNO:126所示的CDR2，SEQIDNO:152所示的CDR3；
（20）SEQIDNO:98所示的CDR1，SEQIDNO:130所示的CDR2，SEQIDNO:157所示的CDR3；
（21）SEQIDNO:99所示的CDR1，SEQIDNO:126所示的CDR2，SEQIDNO:158所示的CDR3；
（22）SEQIDNO:100所示的CDR1，SEQIDNO:131所示的CDR2，SEQIDNO:159所示的CDR3；
（23）SEQIDNO:101所示的CDR1，SEQIDNO:132所示的CDR2，SEQIDNO:160所示的CDR3；
（24）SEQIDNO:102所示的CDR1，SEQIDNO:126所示的CDR2，SEQIDNO:152所示的CDR3；
（25）SEQIDNO:103所示的CDR1，SEQIDNO:133所示的CDR2，SEQIDNO:161所示的CDR3；
（26）SEQIDNO:104所示的CDR1，SEQIDNO:134所示的CDR2，SEQIDNO:162所示的CDR3；
（27）SEQIDNO:105所示的CDR1，SEQIDNO:135所示的CDR2，SEQIDNO:163所示的CDR3；
（28）SEQIDNO:106所示的CDR1，SEQIDNO:136所示的CDR2，SEQIDNO:164所示的CDR3；
（29）SEQIDNO:107所示的CDR1，SEQIDNO:137所示的CDR2，SEQIDNO:165所示的CDR3；
（30）SEQIDNO:108所示的CDR1，SEQIDNO:138所示的CDR2，SEQIDNO:166所示的CDR3；
（31）SEQIDNO:109所示的CDR1，SEQIDNO:139所示的CDR2，SEQIDNO:167所示的CDR3；
（32）SEQIDNO:110所示的CDR1，SEQIDNO:140所示的CDR2，SEQIDNO:168所示的CDR3；
（33）SEQIDNO:111所示的CDR1，SEQIDNO:118所示的CDR2，SEQIDNO:144所示的CDR3；
（34）SEQIDNO:112所示的CDR1，SEQIDNO:126所示的CDR2，SEQIDNO:152所示的CDR3；
（35）SEQIDNO:113所示的CDR1，SEQIDNO:141所示的CDR2，SEQIDNO:170所示的CDR3；
（36）SEQIDNO:114所示的CDR1，SEQIDNO:142所示的CDR2，SEQIDNO:171所示的CDR3；
（37）SEQIDNO:115所示的CDR1，SEQIDNO:126所示的CDR2，SEQIDNO:172所示的CDR3；
（38）SEQIDNO:116所示的CDR1，SEQIDNO:143所示的CDR2，SEQIDNO:174所示的CDR3；
（39）SEQIDNO:117所示的CDR1，SEQIDNO:118所示的CDR2，SEQIDNO:144所示的CDR3。


3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的甲型肝炎病毒检测试剂用于检测样品中甲型肝炎病毒的含量。


4.针对甲型肝炎病毒的单域抗体在制备甲型肝炎诊断试剂或甲型肝炎病毒检测试剂中的应用,其特征在于，所述单域抗体为SEQIDNO:1-41中的任意一条所示的抗体链。


5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于，抗体链的编码序列分别如SEQIDNO：42-82所示。


6.根据权利要求1-5任意一项所述的应用，其特征在于，所述的抗体序列还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、F...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏志鹏，孟巾果，周耿，
申请(专利权)人：南京融捷康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32