抗埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的单克隆抗体4F1及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的单克隆抗体4F1，所述抗体具有独特的CDR区，与EBOV GP1亚基具有特异性的结合活性，并且结合稳定，不受次级内体低pH环境的影响，为其发挥中和作用提供了基础。与对照抗体相比，4F1在体外可有效地中和EBOV假病毒。4F1中和活性随着抗体浓度的升高而增强，在1μg/mL的浓度下即可对EBOV实现100％的保护。本发明专利技术提供的单克隆抗体4F1与MIL77‑3等对照抗体都结合于GP1亚基，且竞争结合，但4F1具有体外中和活性，而其他抗体则不具有中和活性，提示4F1具有与其他结合于GP2亚基的中和抗体组成鸡尾酒组合疗法的潜力。

Monoclonal antibody 4F1 against GP1 subunit of Ebola virus glycoprotein and its application

【技术实现步骤摘要】
抗埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的单克隆抗体4F1及应用
本专利技术公开了一种抗体，属于多肽

技术介绍
埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)能在人类和非人灵长类体内引发急性严重出血热病，是迄今发现的致死率最高的病毒之一，致死率高达90％，可直接通过接触传播，具有极强的传染性和致死率。埃博拉病毒包膜表面上的糖蛋白(Glycoprotein，GP)刺突几乎介导了病毒进入细胞的所有环节，因此埃博拉GP是一个重要的病毒中和抗体作用靶点。埃博拉病毒GP基因被加工成两种蛋白，一种是分泌的非结构型GP(secretedglycoprotein，sGP)；另一种是结构型GP。埃博拉GP首先作为一个多肽被合成，接着被Furin酶酶切成为GP1(1-501位氨基酸)和GP2(502-676位氨基酸)亚基，两个亚基通过二硫键相连接，形成的三聚体由GP2内部的跨膜区固定在于包膜表面。GP1包含黏蛋白(Mucin)、聚糖帽(Glycancap)、头部(Head)、基部(Base)等结构域。Furin酶切后形成的GP结构并不能直接激发埃博拉病毒与宿主细胞膜融合过程的发生。埃博拉病毒进入体内后，与细胞膜表面受体结合，但是这些宿主细胞膜表面的粘附因子，并不是真正的埃博拉病毒发生膜融合进入宿主细胞的受体。病毒结合于细胞表面粘附因子后，由网格蛋白介导胞吞和胞饮，发生初级和次级核内体的运输。GP在核内体中被组蛋白酶B和组蛋白酶L酶切，去除GP1上包括黏蛋白和聚糖帽在内的60％的氨基酸，形成激活态GP(primedGP,GPcl)，此时激活了决定性的膜融合过程的发生。GPcl与内体膜蛋白Niemann-PickC1(NPC1)结合发生膜融合，从而使病毒RNA进入胞质完成病毒基因组复制和转录，新病毒蛋白合成后组装成子代病毒颗粒，并从宿主细胞表面出芽。内体膜蛋白NPC1是EBOV感染的必不可少的宿主感染因子。埃博拉病毒被美国NIH和CDC列为A类生物剂/生物恐怖剂，将其归为对国家安全和公众健康存在重大隐患和风险的病原体之一，目前仍没有获批的预防或治疗埃博拉病毒的药物。1967年埃博拉病毒被发现后，共经历了12次较大规模的传播。2014年西非爆发了历史上最大规模、最难控制的埃博拉疫情，经鉴定为扎伊尔型埃博拉病毒，此次疫情造成1万多例死亡和2.5万多例感染(根据WHO2016年2月17日发布的埃博拉疫情报告)，疫情首次传播到非洲大陆以外，在世界范围内引起了极大的恐慌。公众和当局的高度关注快速推进了埃博拉疫苗和抗病毒药物的研究。国内外迅速开展了几个有前景的埃博拉疫苗临床试验：大猩猩腺病毒3型载体疫苗、腺病毒5型载体疫苗、水疱性口炎病毒载体疫苗等。不可否认地，发展有效的预防类药物是一个重要的目标，并且预防措施被认为可以挽救大量的生命，然而疫苗在某些情况下难以发挥作用，比如：1)宿主个体可能存在差异(如年长者、年幼者及免疫受损者的免疫能力薄弱)；2)疫苗长时间免疫后免疫效果逐渐减弱；3)疫苗激发宿主的免疫无法抵抗高剂量的埃博拉病毒暴露；4)大部分病人仅在出现埃博拉病毒感染信号后才寻求药物帮助，疫苗在短暂的治疗窗口期内难以激发宿主有效的免疫应答。因此，在开发疫苗的进程中埃博拉病毒病治疗药物的研发同样不容忽视。目前埃博拉病毒中和抗体可能通过三种途径发挥保护作用：1)阻断GP被组织蛋白酶酶切水解；2)阻断激活态GP与NPC1受体的结合；3)影响与NPC1受体结合后到膜融合前GP的变构过程。其中，前两种途径已有文献证实，第三种途径为部分文献的推测，尚无直接证据。尽管目前没有批准的埃博拉病毒病治疗药物，但是有一些实验型抗埃博拉病毒药物正在研究当中，包括小干扰RNA、反义寡核苷酸、核苷酸类似物、抗体等。2018年5月，埃博拉疫情在刚果民主共和国再一次爆发，截止到8月12日，造成57人感染，41人死亡。在此次疫情爆发后，WHO批准了5种处于研究阶段的药物，可以被用于应急治疗埃博拉病毒病，其中包括3种抗体药物(Zmapp、REGN3470-3471-3479和mAb114)和2种小分子药物(Remdesivir和Favipiravir)。其中，由三株单克隆抗体混合而成的抗体药物“Zmapp”及其优化株“MIL77”在2014年西非埃博拉疫情爆发期间，成功挽救了多人的生命，其效果和治疗窗口期长度远超于其他种类的抗病毒药物，大大提高了药物安全性和患者治愈率，给了人们极大的鼓舞。应用抗体药物治疗丝状病毒病引起了世界范围内的关注，成为埃博拉病毒病治疗药物研究领域的热点。Zmapp是由烟草系统表达的三株人鼠嵌合单抗(c2G4、c4G7、c13C6)组成的鸡尾酒治疗策略，其中c2G4(表位为C511，N550，G553，C556)和c4G7(表位为C511，D552，C556)结合于GP2亚基，表位存在交叠；c13C6(表位为T270，K272)以近似垂直的角度结合于聚糖帽区域。MIL77是优化于Zmapp的抗体组合，MIL77-1/-2/-3分别含有c2G4、c4G7和c13C6的可变区，其骨架区经人源化改造后表达于CHO细胞。MIL77-1和ML77-3两株抗体的鸡尾酒组合疗法在感染72小时后能够对非人灵长类起到100％的保护活性。鸡尾酒组合疗法所显示的优异效果为埃博拉病毒病的治疗带来了新的启示，研发能够抗独特抗原表位的抗埃博拉病毒单克隆抗体成为本领域的一大技术需求，因为如果具有了更多的、不同于现有技术已经出现的抗独特抗原表位的抗埃博拉病毒单克隆抗体，则对于埃博拉病毒病的治疗方案就有了更多的选择，尤其是鸡尾酒组合制剂的方案设计。因此，本专利技术的目的就是提供一种能够针对独特抗原表位的抗埃博拉病毒糖蛋白的单克隆抗体，进而提供其在制备埃博拉病毒病治疗药物中的应用。
技术实现思路
基于上述目的，本专利技术首先提供了一种抗埃博拉病毒糖蛋白GP2亚基的单克隆抗体4F1，所述抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1的第27-32、50-52和89-97位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5的第26-33、51-57和96-107位氨基酸序列所示。在一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。在一个更为优选的实施方案中，所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述抗体重链恒定的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。其次，本专利技术还提供了一种上述单克隆抗体轻链和重链的基因编码序列，所述抗体的轻链可变区的基因编码序列由SEQIDNO.2所示，所述抗体的重链可变区的基因编码序列由SEQIDNO.6所示。在一个优选的实施方案中，所述抗体的轻链恒定区的基因编码序列由SEQIDNO.4所示，所述抗体的重链恒定区的基因编码序列由SEQIDNO.8所示。再次，本专利技术提供了一种能够表达上述编码单克隆抗体重链和/或轻链的基因编码序列的功能元件。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1的第27-32、50-52和89-97位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5的第26-33、51-57和96-107位氨基酸序列所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1的第27-32、50-52和89-97位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5的第26-33、51-57和96-107位氨基酸序列所示。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。


3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述抗体重链恒定的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。


4.一种编码权利要求1-3任一所述单克隆抗体轻链和重链的基因编码序列，其特征在于，所述抗体的轻链...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，于长明，迟象阳，范鹏飞，张冠英，侯利华，房婷，吴诗坡，陈旖，陈郑珊，王美荣，刘渝娇，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11