PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9及其应用制造技术

本发明专利技术采用PRRSV病毒液‑SD16作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合，病毒感染Marc145细胞筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，获得鼠单克隆抗体5D9。用ELISA技术测定该单克隆抗体5D9的亚型为IgM型单克隆抗体。PRRSV‑I型和PRRSV‑II型病毒感染Marc145细胞，利用IFA技术用该单克隆抗体进行检测，证明单克隆抗体5D9对PRRSV‑I和PRRSV‑II型病毒具有广谱反应性。随后用其进行病毒中和实验，利用Western blot技术和qPCR技术证明该单克隆抗体对PRRSV‑I和PRRSV‑II型病毒都具有中和活性，可阻止病毒入侵，保护机体免受感染。

PRRSV broad spectrum neutralization monoclonal antibody 5D9 and its application

【技术实现步骤摘要】
PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9及其应用
;本专利技术属于生物领域，具体涉及一种具有广谱中和活性的PRRSV单克隆抗体，能广谱中和I型和II型病毒，可以用于猪繁殖与呼吸综合征的治疗药物的开发。
技术介绍
：猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的以母猪流产和仔猪呼吸障碍为主要特征的病毒性传染病，并能引起严重的免疫抑制。该病毒已在全球猪群中广泛传播，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，已成为全球规模化猪场的主要疫病之一，也是全球猪病控制上的一大难题。PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。目前PRRSV有两种基因型：1型亦称欧洲型（Lelystad原型）和2型亦称北美型（VR2332原型），PRRSV-1和PRRSV-2株核苷酸序列约有60%相似性。其中PRRSV-II型病毒包括VR2385，VR2332，CH1a，SD16等，PRRSV-I型毒目前中国发现的有GZ11。中和抗体是当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。中和抗体在抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染过程中起重要作用,在自然感染PRRSV的过程中，中和抗体产生较晚，为病毒在宿主体内大量复制并感染其他易感动物提供了充裕的时间。然而被动输入PRRSV的中和抗体可预防PRRSV感染妊娠母猪，并且对母猪和仔猪都可起到消除性免疫作用。然而由于不同PRRSV毒株的核酸序列差别较大存在抗原性存在差异，导致单一毒株致弱的PRRSV弱毒疫苗难以对核酸序列差别较大的野毒难以产生完整的保护。另一方面，临床上也有报道在猪群上也检测个别PRRSV感染猪个体的血清样本含有的多克隆血清可同时中和1型和2型PRRSV病毒的感染，提示不同来源的PRRSV病毒上存在保守的抗原表位可刺激机体产生广谱中和抗体，例如EricNelson对来自一个群体的5个血清样品试验使用多个1型和2型PRRSV分离株进行检测，血清与90%的2型PRRSV毒株发生反应，滴度为16-56；并意外发现可与90%的1型PRRSV发生反应，滴度大于80（陈错等，《猪业科学》，2017,34（4）：25-26）。现有技术中也出现了具有较高中和活性的单克隆抗体，例如刘梦莹等（《中国预防兽医学报》，2019,41（6）：641-644）制备的MAbLM26仅针对PRRSVSD53株具有中和活性，中和效价最高为1:50；B.Pirzadeh等（JournalofGeneralVirology(1997),78,1867–1873）所制备的针对GP5的单克隆抗体对于美洲型VR-2332具有中和活性，中和效价为1:32-1:128，但是其对于欧洲型（Lelystad原型）不具备中和活性。但是，现有研究中尚未报道具有广谱中和的单克隆抗体及其应用。本专利技术鉴定出一株PRRSV特异性单克隆抗体，其所识别的保守表位广泛存在于不同基因型的PRRSV毒株，并且该抗体可在体外实验上中和不同PRRSV毒株对易感细胞的感染。
技术实现思路
：针对现有技术中缺乏PRRSV广谱中和抗体的问题，本专利技术鉴定出一株PRRSV广谱中和抗体5D9，对于PRRSV-I型和PRRSV-II型病毒均具有较高的中和活性，可以用于PRRSV的检测和猪繁殖与呼吸综合征的治疗药物的开发。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术手段：一种PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo：1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。本专利技术还请求保护所述PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9的编码DNA，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区的编码DNA序列如SEQIDNo：3所示；所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQIDNo：4所示。所述单克隆抗体5D9为IgM亚型。本专利技术还请求保护所述PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9在制备PRRSV检测试剂盒中的应用，优选的，所述检测试剂盒为ELISA检测试剂盒或者试纸条，所述试纸条为胶体金试纸条。本专利技术还请求保护所述PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9在制备治疗PRRSV感染的药物中的应用。优选的，所述PRRSV感染为PRRSV-I型和PRRSV-II型病毒同时或单独感染。本专利技术还请求保护所述PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9在制备预防PRRSV感染的药物中的应用。优选的，所述PRRSV感染为PRRSV-I型和PRRSV-II型病毒同时或单独感染。本专利技术还请求保护由单克隆抗体5D9重链可变区和轻链可变区在抗体制备中的应用，所述抗体为单克隆抗体，基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、猪源单克隆抗体等。基于以上技术方案，本专利技术具有如下技术效果：本专利技术采用PRRSV病毒液-SD16作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合，病毒感染Marc145细胞筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，获得鼠单克隆抗体5D9。用ELISA技术测定该单克隆抗体5D9的亚型为IgM型单克隆抗体。PRRSV-I型和PRRSV-II型病毒感染Marc145细胞，利用IFA技术用该单克隆抗体进行检测，证明单克隆抗体5D9对PRRSV-I和PRRSV-II型病毒具有广谱反应性。随后用其进行病毒中和实验，利用Westernblot技术和qPCR技术证明该单克隆抗体对PRRSV-I和PRRSV-II型病毒都具有中和活性，可阻止病毒入侵，保护机体免受感染。附图说明：图1：单克隆抗体5D9病毒中和实验结果图：图1-A为Westernblot检测结果，其中SD16表示PRRSV-SD16病毒；IsotypeControl为同型对照组，即未感染PRRSV的小鼠IgM；N表示基于PRRSV-N蛋白检测表征的病毒繁殖水平；α-Tublin为α微管蛋白，作为Westernblot内参。图1-B为基于荧光定量PCR检测PRRSV-N基因mRNA表达水平的检测结果。图2：单克隆抗体5D9广谱反应活性测定结果图。图3：单克隆抗体5D9广谱中和活性测定结果图。图4：单克隆抗体5D9腹水中和活性的检测结果图：图4-A，单克隆抗体5D9腹水针对PRRSV-SD16病毒（PRRSV-II型）的中和效价；图4-B，单克隆抗体5D9腹水针对PRRSV-GZ11病毒（PRRSV-I型）的中和效价。具体实施方式：下面列出具体实施方案对本专利技术做进一步阐述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：/n所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；/n所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo：1所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。


2.根据权利要求1所述的PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9的编码DNA，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQIDNo：3所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQIDNo：4所示。


3.根据权利要求1所述的PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9，其特征在于，所述单克隆抗体5D9为IgM亚型。


4.根据权利要求1所述的PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9在制备PRRSV检测试剂盒中的应用，优选的，所述检测试剂盒为ELISA检测试剂盒或者试纸条...

【专利技术属性】
技术研发人员：南雨辰，周恩民，武春燕，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61