三维打印的器官、设备和基质制造技术

本文提供了用于生物打印三维器官和类器官的方法和系统。本文还提供了生物打印的三维器官和类器官用于生成和/或评估免疫学产物和/或免疫应答的用途。本文还提供了用于生物打印三维基质的方法和系统。

Organs, devices and substrates for 3D printing

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】三维打印的器官、设备和基质交叉引用本申请要求于2017年5月25日提交的美国临时专利申请号62/511,205、于2017年5月25日提交的美国临时专利申请号62/511,275、于2017年9月8日提交的美国临时专利申请号62/556,242的优先权，其中每个申请均通过引用整体并入本文。
技术介绍
迄今为止，尽管在细胞生物学、微流体、工程学和三维打印领域取得了显著进展，但常规方法未能再造供给并支撑构建人体器官所必需的厚组织的功能性毛细血管。迄今为止，组织工程学中的这些方法依赖于血管向组织工程化设备中的内向生长，以实现持久的脉管形成。该策略适用于一些非常薄的组织(如膀胱壁置换)或不需要脉管系统工作的组织(如骨置换)。然而，当前的组织工程化技术在产生复杂组织如大型重要器官(包括肝、肾、厚皮和心脏)方面达不到要求。较大的组织也可以看作是较小的组织亚单位的组织；例如，肾由数十万个肾单位组成，肺的功能单位(即肺泡腔)的总表面积为70至80平方米(m2)，但其仅为1个细胞壁，厚度为5至10微米(μm)。当前的组织打印方法不仅不能再造支撑厚度大于300微米(μm)的组织所必需的精细微脉管系统，而且不能将细胞组织成器官功能所必需的结构取向和小生境。抗体是在免疫应答期间由B细胞产生和分泌的蛋白质。抗体可对潜在的感染因子具有高的结合特异性和亲和力，因此可用于结合并隔离、中和其他蛋白质、病毒、细菌、化学制品-蛋白质组合或碳水化合物分子或者改变其作用。这使抗体在保护免受病原体侵害以及隔离或中和感染性或其他病理因子或蛋白质方面成为有价值的蛋白质。另外，通过借助于破坏或增强其他蛋白质-蛋白质相互作用的调节，通过吞噬的调理素作用，抗体可用于重定向免疫应答，实质上增加了免疫识别和破坏病原体或病理因子的可能性。为了使B细胞产生高亲和力或高亲抗原性抗体，需要称为亲和力成熟的多步骤过程。在亲和力成熟过程中，B细胞受体(BCR)发生了遗传变化。在这些遗传变化之后，发生了猜测和检验的类似进化的过程。这是一个竞争性过程，其中高结合强度导致与提供阳性存活信号的佐细胞更多接触。佐细胞包括但不限于：T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞等。无效的BCR重排会终止亲和力成熟过程，并且不再接收来自呈递抗原的佐细胞或可以提供额外阳性反馈的自身BCR交联的存活信号。因此，较高亲和力的BCR重排和随机突变给予B细胞阳性反馈、促进B细胞分裂、更多的受体重排和更多的随机突变，而较低亲和力的BCR重排可导致细胞死亡或无反应性。在这种猜测和检验顺序中进行了几轮选择后，高亲和力B细胞差异地存活并转变为浆细胞。浆细胞在血流中循环并分泌大量抗体以辅助免疫应答。亲和力成熟多发生在淋巴结器官中，持续数天时间。淋巴结由网状网络内的大量免疫细胞组成，主要是B细胞、T细胞和滤泡树突细胞(FDC)。淋巴结通过增加细胞彼此之间的接近度而实现全面免疫应答所需的广泛的细胞间相互作用。来自佐细胞的第二存活信号支持B细胞受体重排。这些基于接近度的细胞相互作用需要在淋巴结内发现的免疫细胞进行特定的三维(3D)时空排列，或者通过该特定三维时空排列显著改善。细胞的三维细胞移动和时空排列对于几种基于细胞的过程至关重要，这些过程包括细胞分化和细胞对外部或内部刺激的反应。在B细胞的亲和力成熟过程中，所涉及的免疫细胞在淋巴结中物理区室化为含有分裂的B细胞的区域(即暗区)、含有非分裂的B细胞的区域(即亮区)和含有支持性佐细胞的区域，如图16所示。免疫细胞的区室化和随后在活化期间的重排指示高亲和力抗体的适当发育依赖于该组织。当B细胞经历亲和力成熟时，它们在淋巴结的各区室之间移动，蠕动穿过其他细胞和胶原网络，如图17所示。本公开内容描述了毫米、微米或亚微米分辨率的含细胞胶原网络的无毒打印过程，使得可以产生具有有限细胞区室化的包含其他细胞类型的淋巴器官或类器官，其目的包括但不限于抗体生成。在类器官的抗原攻击或疫苗接种后在合成组织中从头形成抗原特异性抗体指示了功能性细胞-细胞相互作用和功能性应答组织，该组织可在数天、数周至数月的过程中支持复杂的细胞-细胞相互作用。由于抗体在靶向、中和以及/或者调理与包括癌症、自身免疫病和感染性疾病在内的许多疾病状态有关的生物因子中的高功效和多功能性，因此已经将其用于治疗目的。但是，发现和生产抗体用于治疗或研究用途的当前方法既费时又昂贵。抗体产生的标准方法需要使用动物，通常是小鼠或其他啮齿动物、兔、鸡、马或非人类灵长类动物，向它们注射抗原并在表现出免疫应答后放血以收集B细胞。通过该方法产生的旨在用于对抗人类靶标的抗体(例如，用于治疗目的)的抗体需要额外的费力的人源化步骤，该步骤可能会改变靶标的结合亲和力，同时不能保证在人类中的安全性或效率。其他方法如噬菌体展示使用预定义的抗体文库或序列集，结合一些选择感兴趣的蛋白质的方法。通常，这些文库不产生独特的或高亲和力的序列。此外，作为预定义的蛋白质组，它们可能无法产生对新型感染因子的应答能力。我们的技术解决了两个问题：(a)依赖动物模型进行抗体发现；(b)无法使用衍生自人类的高通量模型来产生高亲和力的独特抗体。所描述的方法涉及光源的使用，该光源包括但不限于白光、蓝光、绿光和任何波长的单光子或多光子激光源。光可以以二维或三维进行投影。通过使用数字微镜器件(DMD)或空间光调制器(SLM)对单个轴向平面进行二维(2D)投影来实现二维投影，该数字微镜器件(DMD)或空间光调制器(SLM)仅将光放置在期望材料聚合的特定区域中。如果使用三维投影，则可以通过使用串联的两个光调制系统通过光的全息投影来实现，如在共同专利技术的题为MULTI-PHOTONTISSUEPRINTING的美国临时专利申请号62/469,948中所公开的，该申请通过引用并入本文。已经描述并实现了生物材料的聚合，以用于细胞支架材料的生物打印。本文所述的方法涉及将光源投影到包含可聚合材料的浴液中以在发生聚合时封装细胞。相比之下，替代的介质内基于聚合的组织工程方法使用光投影来产生3D支架，细胞可随后植入其中。在聚合过程中封装细胞而不是植入细胞增加了细胞可放置的精度；通过使用双光子光源而不是标准的单光子光源进一步提高了在聚合空间内能够实现的分辨率。使用双光子光源引发聚合消除或显著降低了光对细胞的毒性，并且加快了打印速度，从而改善细胞活力和生长。就可获得的分辨率以及可打印大型或复杂结构的速度而言，多光子和单光子激光方法优于挤出打印。或者，可以使用波长更长的光子来减少对细胞的损害，并且/或者可以使用强度较低的光或较短的曝光时间。另外，以期望聚合图案通过光源的全息投影以三维方式同时进行打印大大减少了打印时间，还减少了由于曝光或温育器外的时间而对细胞的压力。用于包括骨骼和皮肤等组织的伤口闭合、伤口修补，如使用支架、骨愈合或融合的最常用医疗设备由生物惰性材料制成。这些材料中的许多可随着时间的流逝而溶解，但许多在手术后的多年仍会保持持久性特征，并可能引起并发症或阻碍愈合过程。用于外科手术伤口闭合或组织修复的一些更先进的材料和医疗设备采用三维挤出打印后接种细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：/n(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；/n(b)根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径，将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，所述3D淋巴类器官包括(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物；以及/n(c)使所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170525 US 62/511,205;20170525 US 62/511,275;20171.一种产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：
(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；
(b)根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径，将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，所述3D淋巴类器官包括(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物；以及
(c)使所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。


2.如权利要求1所述的方法，其中在(c)中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。


3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(d)从所述3D淋巴类器官的所述至少部分提取一种或多种免疫蛋白。


4.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。


5.如权利要求1所述的方法，其中所述多个细胞来自受试者。


6.如权利要求1所述的方法，其中所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。


7.如权利要求1所述的方法，其中所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。


8.如权利要求1所述的方法，其中所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。


9.如权利要求1所述的方法，其中3D淋巴类器官的所述至少所述部分的所述聚合物形成网络。


10.如权利要求9所述的方法，其中所述网络是网状的、无定形的或是网。


11.如权利要求10所述的方法，其中所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。


12.如权利要求10所述的方法，其中所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。


13.一种用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：(i)打印包含含有多个细胞的基质的三维(3D)淋巴类器官，和(ii)处理所述3D淋巴类器官，以产生所述一种或多种免疫蛋白。


14.如权利要求13所述的方法，其中所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。


15.如权利要求13所述的方法，其中所述多个细胞来自所述受试者。


16.如权利要求13所述的方法，其中所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。


17.如权利要求13所述的方法，其中所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。


18.一种用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：
(a)提供包含第一介质的介质室，其中所述第一介质包含第一多个细胞和第一聚合物前体；
(b)根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述介质室中的所述第一介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的第一部分；
(c)在所述介质室中提供第二介质，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；
(d)根据所述计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的第二部分；以及
(e)使所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。


19.如权利要求18所述的方法，其中在(e)中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。


20.如权利要求18所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(f)从所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分提取一种或多种免疫蛋白。


21.如权利要求18所述的方法，其中所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。


22.如权利要求18所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自受试者。


23.如权利要求18所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。


24.如权利要求18所述的方法，其中所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。


25.如权利要求18所述的方法，其中所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。


26.如权利要求18所述的方法，其中3D淋巴类器官的所述至少所述部分的所述聚合物形成网络。


27.如权利要求26所述的方法，其中所述网络是网状的、无定形的或是网。


28.如权利要求27所述的方法，其中所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。


29.如权利要求27所述的方法，其中所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。


30.一种产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：(i)打印包含基质的三维(3D)淋巴类器官，所述基质包含第一多个细胞和第二多个细胞，和(ii)处理所述3D淋巴类器官，以产生所述一种或多种免疫蛋白。


31.如权利要求30所述的方法，其中所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。


32.如权利要求30所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自所述受试者。


33.如权利要求30所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。


34.如权利要求30所述的方法，其中所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。


35.一种用于使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括：
(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；
(b)根据计算机存储器中用于打印所述三维(3D)含细胞医疗设备的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径，将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以形成所述3D含细胞基质的至少一部分，所述3D含细胞基质包含(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物；以及
(c)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。


36.如权利要求35所述的方法，其中所述多个细胞来自所述受试者。


37.如权利要求35所述的方法，其中所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。


38.如权利要求35所述的方法，其中所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。


39.如权利要求38所述的方法，其中所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。


40.如权利要求35所述的方法，其中所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。


41.如权利要求35所述的方法，其中所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。


42.如权利要求41所述的方法，其中所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。


43.一种使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括(i)打印包含多个细胞的所述3D含细胞基质，和(ii)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。


44.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅兰妮·P·马修，凯瑟琳·J·帕金森，艾玛·R·莫尔顿，
申请(专利权)人：普瑞利思生物制品公司，
类型：发明
国别省市：美国;US