一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种SARS‑COV2纤突蛋白抗体，为SARS‑COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。SARS‑COV2纤突蛋白抗体的制备方法，是基于SARS‑COV2的S1蛋白Gln14‑Arg685区域的基因，进行表达和纯化，获得融合蛋白，然后将融合蛋白制备配对抗体。上述的SARS‑COV2纤突蛋白抗体用于制备新型冠状病毒检测试剂盒，本发明专利技术提供了一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒，包括上述的一种SARS‑COV2纤突蛋白抗体。本发明专利技术提供的SARS‑COV2胶体金诊断试剂盒，该试剂盒操作简单，能够快速诊断出患者是否感染SARS‑COV2，利于疫情的有效控制。

A novel coronavirus antigen colloidal gold diagnostic kit

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒
本专利技术涉及新型冠状肺炎检测药物
，具体涉及一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒。
技术介绍
2019新型冠状病毒(COVID-2019)，2020年1月12日被世界卫生组织命名。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。因此对于疾病的预防和早期诊断对于控制新型冠状病毒疫情蔓延尤为重要。纤突蛋白(spikeprotein，S)是冠状病毒的表面结构蛋白，研究表明，新型冠状病毒的S蛋白和SARS冠状病毒S蛋白拥有相同功能的宿主细胞受体，即血管紧张素转换酶2(ACE2，angiotensinconvertingenzyme2)，ACE2与新型冠状病毒S蛋白胞外域结构之间结合的亲和力为15nM(平衡解离常数)，其是ACE2与SARS冠状病毒S蛋白胞外域结构之间结合亲和力的10-20倍。新型冠状病毒和SARS病毒的纤突蛋白同源性较低，两种病毒纤突蛋白的氨基酸序列相似度只有76.47％。但是两种病毒RBD结构域的有一些基因区域与SARS有高度的同源性。其中SARS感染的5个关键位点中，有1个被新型冠状病毒保留，其余4个有氨基酸的替换和变化。特异性针对SARS-CoV纤突蛋白受体结合结构域(RBD)的多克隆抗体不能与2019-nCoV结合，两种病毒的抗体具有限制性。如研究表明，公开研究测试了目前发表的3种针对SARS-CoVRBD区域的多克隆抗体，尽管两种病毒有很高的同源性，但是这三种与SARS-CoVRBD区域能紧密结合的多克隆抗体，在新冠病毒中完全没有结合力。这一结果暗示着，SARS-CoV研究中的抗体或许对2019-nCoV并没有作用，需要针对新冠病毒的特异性来重新设计新抗体。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供了解决上述问题的检测SARS-COV2的S蛋白的快速检测试剂盒，用于检测患者是否患有感染SARS-COV2。本专利技术通过下述技术方案实现：一种SARS-COV2纤突蛋白抗体，为SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤1，基于SARS-COV2的S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，进行表达和纯化，获得融合蛋白；步骤2，基于步骤1制备的融合蛋白制备配对抗体。进一步地，所述步骤1具体操作包括以下步骤：步骤1-1，全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，将S1基因克隆至真核表达载体，构成S1-mFc融合基因。步骤1-2，将S1-mFc表达质粒电转到感受态大肠杆菌，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；步骤1-3，使用转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培养；步骤1-4，收集细胞培养基，离心获得上清，分离纯化S1-mFc融合蛋白。进一步地，步骤1-1中，所述真核表达载体为pMFcIg，S1基因克隆到真核表达载体的IL2分泌信号肽和小鼠Fc标签基因之间，构成S1-mFc融合基因。进一步地，步骤1-1中，克隆所采用的正向引物的核苷酸序列为：CAGTGTGTTAATCTTACAACC，反向引物的核苷酸序列为ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT。进一步地，所述步骤2具体操作包括以下步骤：步骤2-1，建立天然人源单链可变区噬菌体展示库；步骤2-2，将融合蛋白与天然人源单链可变区噬菌体展示库生物筛选；步骤2-3，生物筛选后阳性噬菌体的重链可变区和轻链可变区分别克隆至表达载体中，转入宿主细胞中进行表达和纯化，得到SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。进一步地，所述步骤2-3中，重链可变区的表达载体为pFUSEss-CHIg-hG1，轻链可变区的表达载体pFUSEss-CLIg-hK。上述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体、以及上述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法制备的SARS-COV2纤突蛋白抗体在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒，包括上述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体、以及上述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法制备的SARS-COV2纤突蛋白抗体。一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒的制备方法，用于制备权利要求9所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒，包括以下步骤：步骤1，以氯金酸溶液、柠檬酸三钠水溶液为原料制备胶体金溶液；步骤2，将SARS-COV2纤突蛋白抗体溶液分离纯化；步骤3，将分离纯化后的SARS-COV2纤突的蛋白抗体加入等体积的胶体金溶液中，经分离、沉淀、再溶解获得SARS-COV2胶体金。进一步地，步骤2中，将SARS-COV2纤突蛋白抗体溶液分离纯化的透析方法为：将SARS-COV2纤突蛋白抗体溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2℃～8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。本专利技术具有如下的优点和有益效果：尽管现在研究表明新型冠状病毒(2019-nCoV)和SARS(SARS-CoV)病毒两者RBD结构域的有一些基因区域具有较高的同源性，但是特异性针对SARS-CoV纤突蛋白受体结合结构域(RBD)的多克隆抗体不能与2019-nCoV结合，两种病毒的抗体具有限制性，这一结果表明，SARS-CoV研究中的抗体或许对2019-nCoV并没有作用，需要针对新冠病毒的特异性来重新设计新抗体。本专利技术提供了针对2019-nCoV的特异2019-nCoV性纤突蛋白S1区的配对抗体，能够与2019-nCoV进行特异性结合，采用该抗体制备的胶体金诊断试剂盒，测试操作简单快捷，能够快速、准确诊断出患者是否感染SARS-COV2，利于疫情地有效控制，进一步地防控研究提供一定参考价值。纤突蛋白(S)蛋白是伸出囊膜的球-杆形的病毒融合性糖蛋白，是冠状病毒感染细胞的关键蛋白，是惟一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；决定病毒感染的种属特异性和组织亲嗜性，是病毒毒力的主要决定部分。因S蛋白与机体直接接触，若能检测到S蛋白将对疾病的诊断提供重要依据。另外，与其他检测患者体内的SARS-COV2抗体的检测方法相比，检测抗体的方法只能表明人体免疫系统产生了针对SARS-COV2的抗体，不能反映病毒在患者体内的携带情况，本专利技术通过直接检测SARS-COV2的S蛋白，能直接反映患者体内的病毒携带情况，更有利于疫情的控制。因此本专利技术通过专利技术一对抗体(SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体)，通过双抗体夹心法检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SARS-COV2纤突蛋白抗体，其特征在于，为SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种SARS-COV2纤突蛋白抗体，其特征在于，为SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。


2.基于权利要求1提供的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，基于SARS-COV2的S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，进行表达和纯化，获得融合蛋白；
步骤2，基于步骤1制备的融合蛋白制备配对抗体。


3.根据权利要求2所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体操作包括以下步骤：
步骤1-1，全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，将S1基因克隆至真核表达载体，构成S1-mFc融合基因。
步骤1-2，将S1-mFc表达质粒电转到感受态大肠杆菌，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；
步骤1-3，使用转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培养；
步骤1-4，收集细胞培养基，离心获得上清，分离纯化S1-mFc融合蛋白。


4.根据权利要求3所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤1-1中，所述真核表达载体为pMFcIg，S1基因克隆到真核表达载体的IL2分泌信号肽和小鼠Fc标签基因之间，构成S1-mFc融合基因。


5.根据权利要求3所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤1-1中，克隆所采用的正向引物的核苷酸序列为：CAGTGTGTTAATCTTACAACC，反向引物的核苷酸序列为ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT。


6.根据权利要求2至5任一项所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体操作包括以下步骤：
步骤2-1，建立天然人源单链可变区噬菌体展示库；
步骤2-2，将融合蛋白与天然...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨正林，串俊兰，龚波，石毅，蒋黎，黄璐琳，龙腾镶，刘东泽，徐雨，干盈盈，
申请(专利权)人：四川省人民医院，
类型：发明
国别省市：四川;51