一种食用油中丙烯酰胺的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种食用油中丙烯酰胺的测定方法，包括以下步骤：(1)前处理；(2)标准溶液的配制；(3)获得液相色谱图、回归方程；(4)定性分析；(5)定量计算，采用稳定同位素内标法定量：根据试样中丙烯酰胺定量离子对和

A method for the determination of acrylamide in edible oil

【技术实现步骤摘要】
一种食用油中丙烯酰胺的测定方法
本专利技术涉及一种食用油中丙烯酰胺的测定方法，属于食品检测

技术介绍
丙烯酰胺为一种含氮极性有机小分子，是有机合成材料的单体，是生产医药、染料、涂料的中间体。1994年被国际癌症研究机构(IARC)列为2A类致癌物，对动物具有神经毒性、生殖毒性、致突变性和致癌性等多种毒副作用。早期人们对丙烯酰胺的关注主要集中在职业暴露方面，2002年瑞典科学家首次报道在烘烤、油炸等食品中发现丙烯酰胺，其中油炸薯条中丙烯酰胺含量高达3.9mg/kg。自此丙烯酰胺在食品中的污染问题引起了人们的高度关注，美国、欧盟、加拿大及我国等多个国家开展了不同类型食品中丙烯酰胺水平的监测和研究，并及时将数据公开以期能获得不同食品中丙烯酰胺的污染情况。2005年世界卫生组织(WHO)等机构警告公众关注食品中的丙烯酰胺，呼吁采取措施减少食品中的内烯酰胺含量，确保食品的安全性。世界卫生组织规定饮用水中丙烯酰胺含量不能超过0.5μg/L，目前各国对食品中的丙烯酰胺均没有限量值规定。油炸或焙烤等经高温加工的食品中存在不同含量的丙烯酰胺，研究表明丙烯酰胺的形成与加工烹调方式、温度、时间、水分等有关，因此不同食品加工方式和条件不同，其形成丙烯酰胺的量有很大不同。在实际食品加工、餐饮行业及家庭烹饪中存在食用油反复煎炸使用，煎炸温度过高等问题，使得油炸食品成为丙烯酰胺高风险食品，带来了较大的安全隐患。食品中丙烯酰胺的产生机理较复杂，目前较接受的形成途径有天冬氨酸途径和丙烯醛、丙烯酸途径。前一种为游离天门冬氨酸(土豆和谷类中的代表性氨基酸)与还原糖，二者发生Maillard系列反应生成丙烯酰胺。此外，食物中油脂类物质也会反应生成丙烯酰胺，主要原理是甘油三酯等通过水解、氧化等反应生成小分子物质丙烯醛，丙烯醛经由直接氧化反应生成丙烯酸，烯酸再与氨水作用进一步生成丙烯酰胺。丙烯酰胺产生机理仍存在较大争议，需要通过分析不同情况下丙烯酰胺的产生情况研究其产生途径，从而有目的的消除或降低丙烯酰胺的摄入量。G.Daniali等人通过模型研究的方式研究了植物油和动物油脂在加热处理后丙烯酰胺的产生情况，也报道了不同氨基酸、不同煎炸次数及不同加热温度对棕榈油和大豆油中丙烯酰胺产生量的区别，以此来验证丙烯酰胺的产生途径，其研究表明，添加了天冬氨酸的不同食用油经高温加热后会产生不同含量的丙烯酰胺，且其产生量同过氧化值、碘值、茴香胺值呈正相关。食用油模型研究有一定的局限性，研究真实煎炸不同食品时不同食用油中丙烯酰胺的产生情况有一定的必要性。目前对丙烯酰胺的检测方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)、毛细管电泳法和传感器法等。其中气相色谱法和气相色谱-质谱法需要衍生，前处理较复杂，使用溴化试剂，条件苛刻等缺点。液相色谱法灵敏度较差，干扰严重，而液相色谱-串联质谱法因其高灵敏度、高选择性、定量定性准确及不需要衍生等特点，成为食品中丙烯酰胺检测的主要方法。目前食品中丙烯酰胺检测常用的前处理方法有固相萃取柱法，基质分散固相萃取，液液萃取及分子印迹等方法，这些方法对于食用油这种基质复杂样品存在净化效果差，操作繁琐、样品回收率低等缺点。我国现行食品中丙烯酰胺的检测标准主要有GB5009.204-2014(HPLC-MS/MS法和GC-MS法)和SN/T2096-2008(GC-MS)，其中GB5009.204-2014的HPLC-MS/MS法中采用丙烯酰胺经典前处理方法，即水提取后双固相萃取柱净化方法，存在操作复杂，回收率低等缺点，而GC-MS法还需要衍生等步骤，操作步骤相对比较繁琐，前处理时间长。食用油的主要成分是不饱和脂肪酸的甘油酯，相对分子质量一般在800以上，而丙烯酰胺一般为小分子，采用凝胶渗透色谱(GPC)将丙烯酰胺与油脂基体分离。目前GPC已用于一些含油样品的油脂分离，但用于食用植物油中丙烯酰胺的检测至今未有报道。凝胶渗透色谱(GPC)是一种用溶剂作流动相，多孔填料或多孔交联高分子凝胶作分离介质的液相色谱法，该方法利用化合物中各组分的分子量大小不同，与柱填料之间的作用不同，导致洗脱时间不同而达到分离的目的。凝胶渗透色谱作为一种样品净化手段，在国内外已得到较为普遍的应用，尤其是在富含脂肪、色素等大分子的样品分离净化方面，GPC具有明显优势，目前此系统是从高分子量基体中分离出低分子量化合物的最有效手段。本研究首次系统的建立了食用油中丙烯酰胺的凝胶色谱-液相色谱-串联质谱(GPC-UPLC-MS/MS)检测方法，本方法通过凝胶渗透色谱(GPC)净化植物油样品提取液，除去样品中的油脂及干扰物，再采用液相色谱-串联质谱法进行测定，取得满意效果。方法的系统研究对于食品加工行业及餐饮行业中食用油反复煎炸使用进行更好的监测和指导，对行业发展及政府监管提供技术支持。
技术实现思路
本研究利用凝胶色谱净化，结合稳定性同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱技术，发展了一种简便、高效、准确检测食用油中丙烯酰胺的定性定量方法。为了解决上述问题，本专利技术提供一种食用油中丙烯酰胺的检测方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种食用油中丙烯酰胺的测定方法，包括以下步骤：(1)前处理：称取2.0g样品(精确至0.0001g)，加入置于10mL玻璃刻度管中，用乙酸乙酯－环己烷(1:1,V:V)混合溶液定容至刻度，涡旋1min，过0.45μm有机滤膜后上GPC净化。将收集的流分于45℃下氮气流下浓缩至10mL，加10mL水充分涡旋混合进行液液萃取，冷冻1h后，离心取水相过0.22μm有机滤膜，待上机。(2)标准溶液的配置：分别准确称取丙烯酰胺及丙烯酰胺同位素内标标准物质10mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1mg/mL标准储备液，于-20℃下避光保存；使用前根据需要用水稀释至适当浓度的标准工作液，4℃下避光保存。(3)获得液相色谱图、回归方程将标准系列工作液分别注入超高效液相色谱-串联质谱联用仪，获得相应的丙烯酰胺及其内标标准质量色谱图；以丙烯酰胺定量离子对和13C3丙烯酰胺内标定量离子对的标准质量色谱图的色谱峰面积比为纵坐标，以标准工作溶液中丙烯酰胺的相应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程；(4)定性分析试样用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得试样质量色谱图；若试样质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有丙烯酰胺；(5)定量计算采用同位素内标法定量：根据试样中丙烯酰胺定量离子对和13C3丙烯酰胺内标定量离子对色谱峰的面积，采用步骤(3)的回归方程，计算得到丙烯酰胺的浓度；优选地，所述凝胶渗透色谱净化柱:LabTech高效不锈钢净化柱,ID20×300mm,填料:Bio-BeadsS-X3200-400目，22g；所述凝胶渗透色谱流动相:乙酸乙酯－环己烷(1:1,V:V)。优选地，凝胶渗透色谱净化程序为:0～22min弃去流分，收集22～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种食用油中丙烯酰胺的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)前处理：称取2.0g样品，加入置于10mL玻璃刻度管中，用乙酸乙酯－环己烷(1:1,V:V)混合溶液定容至刻度，涡旋1min，过0.45μm有机滤膜后上GPC净化；将收集的流分于45℃下氮气流下浓缩至10mL，加10mL水充分涡旋混合进行液液萃取，冷冻1h后，离心取水相过0.22μm有机滤膜，待上机；/n(2)标准溶液的配置：分别准确称取丙烯酰胺及丙烯酰胺同位素内标标准物质10mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1mg/mL标准储备液，于-20℃下避光保存；使用前根据需要用水稀释至适当浓度的标准工作液，4℃下避光保存；/n(3)获得液相色谱图、回归方程/n将标准系列工作液分别注入超高效液相色谱-串联质谱联用仪，获得相应的丙烯酰胺及其内标标准质量色谱图；/n以丙烯酰胺定量离子对和

【技术特征摘要】
1.一种食用油中丙烯酰胺的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)前处理：称取2.0g样品，加入置于10mL玻璃刻度管中，用乙酸乙酯－环己烷(1:1,V:V)混合溶液定容至刻度，涡旋1min，过0.45μm有机滤膜后上GPC净化；将收集的流分于45℃下氮气流下浓缩至10mL，加10mL水充分涡旋混合进行液液萃取，冷冻1h后，离心取水相过0.22μm有机滤膜，待上机；
(2)标准溶液的配置：分别准确称取丙烯酰胺及丙烯酰胺同位素内标标准物质10mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1mg/mL标准储备液，于-20℃下避光保存；使用前根据需要用水稀释至适当浓度的标准工作液，4℃下避光保存；
(3)获得液相色谱图、回归方程
将标准系列工作液分别注入超高效液相色谱-串联质谱联用仪，获得相应的丙烯酰胺及其内标标准质量色谱图；
以丙烯酰胺定量离子对和13C3丙烯酰胺内标定量离子对的标准质量色谱图的色谱峰面积比为纵坐标，以标准工作溶液中丙烯酰胺的相应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程；
(4)定性分析
试样用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得试样质量色谱图；若试样质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有丙烯酰胺；
(5)定量计算
采用同位素内标法定量：根据试样中丙烯酰胺定量离子对和13C3丙烯酰胺内标定量离子对色谱峰的面积，采用步骤(3)的回归方程，计...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳侠，刘艳明，徐向军，孙珊珊，赵慧男，祝建华，李晓，宿书芳，薛霞，郑文静，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37