本发明专利技术具体涉及一种从罗非鱼鱼皮中提取ACE抑制肽的方法。罗非鱼鱼皮是一种富含胶原蛋白的副产品，作为ACE抑制剂的筛选原料具有重要的开发意义。本发明专利技术设计提供一种以罗非鱼鱼皮为原料的ACE抑制剂提取方法，包括如下步骤：将罗非鱼鱼皮脱脂后粉碎，加入酸液提取得到鱼皮胶原粗蛋白，向该鱼皮胶原粗蛋白中加入酶进行酶解，保留酶解产物中分子量小于3kDa的部分即为上述ACE抑制肽；特别的，上述酶是枯草芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌在明胶诱导发酵下的产物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及胶原蛋白提取，具体涉及一种从罗非鱼鱼皮中提取ace抑制肽的方法、所述方法提取的ace抑制肽及其在临床和药物开发方面的应用。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、罗非鱼具有杂食性和强繁殖能力，是主要的养殖鱼类品种，也是我国淡水养殖品种的重要组成部分，不仅因口感鲜美受到食客的青睐，罗非鱼的副产物也具有较高的应用价值，其中，罗非鱼鱼皮富含胶原蛋白，并且以ⅰ型和ⅲ型居多，与人体皮肤中胶原蛋白种类具有较高的相似性，因此，罗非鱼鱼皮有望应用于制造伤口敷料、人工皮肤等医疗用品，这些产品具有良好的生物相容性和可塑性，满足了医疗领域的特殊需求。另外，鱼皮中胶原蛋白的水解产物还被报道具有良好的医疗活性，如抗菌肽、降压肽等，具体如血管紧张素转化酶(ace)抑制肽的制备。
3、血管紧张素转化酶抑制剂(acei)是一种ace抑制活性的物质，也是常用的降压药，包括卡托普利、依那普利、雷米普利等，其降压机制是：（1）抑制ace活性：acei抑制血浆及组织中的ace，减少体循环中及心、肾、血管等组织中血管紧张素ⅱ的形成，减弱血管紧张素ⅱ收缩血管、促心肌和血管肥厚、促醛固酮分泌等作用，引起外周血管阻力降低，动脉顺应性改善，水钠潴留减轻，并可阻止心肌与血管重构。（2）抑制缓激肽降解：使血中缓激肽含量升高，进而促进一氧化氮(no)和前列环素(pgi2)生成，加强其扩血管、降血压作用。
<
p>4、目前针对鱼皮中胶原蛋白的提取，主要的方法包括酸提、碱提或酶解提取，酸/碱提取的方式会对胶原蛋白结构造成一定破坏，酶解方式主要采用动物胶原酶（如胰蛋白酶）、植物胶原酶（如木瓜蛋白酶）或微生物胶原酶实现胶原蛋白大分子的水解。微生物胶原酶是某些微生物在特定环境下分泌的可降解胶原的蛋白酶类，具有以下优点：降解彻底、降解位点更为丰富、可适应的底物种类更多，并且可以通过发酵方式进行批量制备。
技术实现思路
1、针对上述现状，本专利技术认为，罗非鱼鱼皮作为一种富含胶原蛋白的副产品，从中筛选高活性的ace抑制剂具有重大的经济意义。为了获取更为彻底的酶解效果，提高酶解产物活性，设计诱导、培育一种更为适宜的微生物胶原酶有望实现上述技术效果。枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌是现有技术报道具有胶原酶分泌活性的菌种，本专利技术尝试对上述具有胶原酶分泌活性的品种进行诱导培养，以期获得活性更高、酶解更为彻底的微生物胶原酶产品。
2、基于上述技术思路，本专利技术提供如下的技术方案：
3、本专利技术第一方面，提供一种从罗非鱼鱼皮中提取ace抑制肽的方法，包括如下步骤：
4、将罗非鱼鱼皮脱脂后粉碎，加入酸液提取得到鱼皮胶原粗蛋白，向该鱼皮胶原粗蛋白中加入酶进行酶解，保留酶解产物中分子量小于3kda的部分即为上述ace抑制肽；特别的，上述酶是枯草芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌在明胶诱导发酵下的产物。
5、上述制备方法中，所述鱼皮胶原粗蛋白的提取工艺，具体如下：
6、所述脱脂为采用异丙醇溶液浸泡处理，异丙醇溶液的浓度为8~12%，浸泡时间为20~40h，为了提高脱脂的效果，上述鱼皮应当是预先处理干净的，充分去除鱼皮表面的脂肪、筋膜组织，剪切成小块再浸泡脱脂。
7、所述粉碎可用高速研磨的方式，以粉碎后粉末颗粒直径180-220μm为宜，可行的研磨方式如球磨，本专利技术提供的一种效果更好的实施方式中，对脱脂后的鱼皮预先冷冻干燥，再进行球磨有利于提高粉碎效率。
8、所述酸液优选为无机酸溶液，如甲酸、乙酸或丙酸，浓度为500~700mmol/l，提取时间为70~80h，提取过程为常温；提取结束后对反应体系进行离心，保留溶液部分盐析得到上述鱼皮胶原粗蛋白；所述盐析优选无机盐，如氯化钠或硫酸铵。
9、上述制备方法中，所述酶的制备方法如下：将枯草芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌在明胶诱导的条件下发酵，对发酵产物进行盐析得到上述酶。
10、进一步的，上述发酵过程中，培养基中明胶的含量为0.4~0.6%，所述培养基以明胶和蛋白胨作为氮源，两者的质量比为0.8~1.2:1。
11、现有研究中，明胶常作为固体或半固体培养基的凝固剂，用于固定、观察细菌的生长状态，此时明胶的添加量为10~12%。本专利技术设想通过添加明胶作为发酵底物诱导微生物中胶原酶的分泌，经验证，当培养基中明胶添加量处于0.4~0.6%时，可以有效提高微生物发酵产物中胶原酶的活力。本专利技术以能够分泌胶原酶的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌作为实验对象，经验证，凝胶芽孢杆菌在上述诱导培养的方式下具有更好的响应性，发酵产物中胶原酶的酶活力更高，本专利技术对上述两种菌株诱导发酵的酶产品进行了明胶酶谱检测，结果表明，凝结芽孢杆菌的发酵生成的酶中具有含量更高的基质金属蛋白酶，作用于间质胶原具有更高的分解效率和特异性。
12、本专利技术验证的一种实施方式中，上述诱导发酵培养的方式如下：
13、将枯草芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌接种至种子液培养基中发酵培养一段时间后接种至发酵罐中进行培养，接种量为5~7%，搅拌速度220~270r/min，通气量2.5~3.5l/min，发酵温度为30~38℃，发酵时间30~36h，发酵培养基中包括如下成分：2.0%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.4~0.6%明胶，0.1%cacl2，0.4%na2hpo4，0.03％ kh2po4，余量为水，ph为7.5。
14、上述制备方法中，所述酶解的反应参数如下：向鱼皮胶原粗蛋白中加入酶进行酶解，酶的加入量为1200~1700u/g粗蛋白，反应时间1.5~3h，温度38℃，ph7.0~7.2。酶解反应结束后，可以通过高温灭活的方式结束酶解，也可以直接进行后续步骤，视生产目的可灵活调整。
15、上述酶解反应结束后，对反应体系进行离心保留溶液部分，采用截留分子量为3kda的超滤膜进行超滤，截留部分即为所述ace抑制肽。
16、本专利技术第二方面，提供第一方面所述方法制备的ace抑制肽。
17、上述ace抑制肽是一种分子量小于3kda小肽混合物，本专利技术通过ace抑制活性验证了，上述ace抑制肽具有良好的抑制活性，特别是凝结芽孢杆菌明胶诱导产酶的ace抑制肽，其抑制活性显著优于其它小肽。
18、基于上述ace抑制肽的抑制活性，有望作为一种ace抑制剂应用于高血压、充血性心力衰竭与心肌梗死、糖尿病性肾病和其他肾病的临床治疗及相应的药物开发。特别是在降压药物领域，ace抑制剂具有本领域公认的降压活性，因此，本专利技术还提供如下的技术方案：
19、本专利技术第三方面，提供一种药物组合物，所述组合物中包括第一方面所述的ace抑制肽。
20、第四方面，提供第二方面所述ace抑制肽、第三方面所述药物组合物在制备降压药中的应用。
21、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
22本文档来自技高网
...
【技术保护点】
1.一种从罗非鱼鱼皮中提取ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱脂的步骤如下：去除鱼皮表面的脂肪、筋膜组织，剪切成小块加入异丙醇溶液中浸泡脱脂；异丙醇溶液的浓度为8~12%，浸泡时间为20~40h。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粉碎的步骤如下：对脱脂后的罗非鱼鱼皮预先冷冻干燥，再进行球磨，粉碎后粉末颗粒直径为180-220μm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸液为乙酸溶液，浓度为500~700mmol/L，提取时间为70~80h，提取过程为常温。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，提取结束后对反应体系进行离心，保留溶液部分盐析得到所述鱼皮胶原粗蛋白；所述盐析采用氯化钠或硫酸铵。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述明胶诱导发酵培养的方式如下：
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的反应参数如下：向鱼皮胶原粗蛋白中加入酶进行酶解，酶的加入量为1200~1700U/g粗蛋白，反应时间1.5~3h，温度38℃，pH7.0~7.2。
8.权利要求1-7任一项所述方法制备的ACE抑制肽。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物中包括权利要求8所述的ACE抑制肽。
10.权利要求8所述的ACE抑制肽、权利要求9所述的药物组合物在制备降压药中的应用。
...
【技术特征摘要】
1.一种从罗非鱼鱼皮中提取ace抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱脂的步骤如下：去除鱼皮表面的脂肪、筋膜组织，剪切成小块加入异丙醇溶液中浸泡脱脂；异丙醇溶液的浓度为8~12%，浸泡时间为20~40h。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粉碎的步骤如下：对脱脂后的罗非鱼鱼皮预先冷冻干燥，再进行球磨，粉碎后粉末颗粒直径为180-220μm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸液为乙酸溶液，浓度为500~700mmol/l，提取时间为70~80h，提取过程为常温。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，提取结束后对...
【专利技术属性】
技术研发人员：李新江，巩力溶，孙铜，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。