一种β2微球蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种β2微球蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒及使用方法。本发明专利技术提供的试剂盒包括β2微球蛋白R1试剂、β2微球蛋白R2试剂和β2微球蛋白校准品，其中β2微球蛋白R1试剂包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；β2微球蛋白R2试剂包含抗人β2微球蛋白的多克隆抗体包被甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；β2微球蛋白校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、β2微球蛋白抗原及缓冲液。本试剂盒特异性强、线性范围宽、均一稳定、快速简便，可用于各种生化分析仪。

A \u03b2 2-microglobulin latex immunoturbidimetric enhancement kit and its application

【技术实现步骤摘要】
一种β2微球蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒及应用
本专利技术涉及一种利用胶乳增强免疫比浊方法测定人体体液中β2微球蛋白含量的试剂盒，属于医学免疫体外诊断领域。
技术介绍
β2微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）是一种内源性低分子量血清蛋白质，由淋巴细胞和其他大多数的有核细胞分泌，在免疫应答中起重要作用。血清β2-MG极易通过肾小球滤过膜，滤过的β2-MG99.9%被近曲小管细胞重吸收和降解，不再返流入血。正常人β2-MG的合成速度和细胞膜释放的量是非常恒定的，从而使β2-MG含量保持稳定水平。临床上检测血或尿中的β2-MG浓度为临床肾功能测定、肾移植成活、糖尿病肾病、重金属镉、汞中毒以及某些恶性肿瘤的临床诊断提供较早、可靠和灵敏的指标。临床上测定β2-MG的方法有放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、时间分辨荧光免疫分析法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、胶乳免疫散射比浊法、胶乳增强免疫比浊法等。ELISA法(酶联免疫吸附法)：0.8～2.4mg/L。目前已报告的测定血清及尿液中的β2-M的方法有多种,有的方法检测灵敏度低,仅能用于测定血清标本中的β2-M浓度,不能用于含β2-M浓度较低的尿液及其它体液标本的测定。通过实验表明胶乳免疫散射比浊法与RIA法一样,具有同样的准确性、特异性和敏感度,无前带现象,适用于血清及尿液的检测,是一种比较方便实用的自动化分析方法。抗原过量的安全范围主要与试剂的质量有关，试剂盒的配方至关重要，包括抗体质量（纯度、效价）、抗体浓度、缓冲体系、聚乙二醇（PEG）的分子大小和浓度选择、胶乳交联技术等多个方面。配方好的试剂盒若其分析测量范围足够宽，可以覆盖所有临床可见的样本浓度，就不会存在钩状效应。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题而提供。本专利技术试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法定量检测β2微球蛋白，其原理是：利用化学交联法将特异的抗人β2微球蛋白抗体包被到甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳表面，当被测样本中有β2微球蛋白抗原时发生抗原抗体免疫反应，形成抗原-抗体-甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳复合物，形成的复合物可与邻近的胶乳颗粒通过寡核苷酸链杂交连接增强结合力，最终交织成网状引起反应体系浊度的显著变化，保持反应体系中抗体过量时，此时反应后体系浊度的变化与β2微球蛋白的量成正比关系，根据β2微球蛋白校准曲线即可进行定量分析。本专利技术通过以下技术方案实现：其中试剂1为稀释液(含有pH6.6，0.1mol/L柠檬酸缓冲液和0.1%Proclin300溶液),试剂2为胶乳试剂(含有包被有β2-微球蛋白抗体的0.3μm直径的甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳(上海羧菲生物医药科技有限公司)和0.1%Proclin300溶液),(1)β2微球蛋白R1试剂，是一种为试剂盒提供适当反应环境、使抗原保持天然构象、并控制反应达到终点的时间和速率的试剂，包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液。(2)β2微球蛋白R2试剂，是一种含有抗人β2微球蛋白的多克隆抗体包被甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳的均一的乳白色液体，包含抗人β2微球蛋白多克隆抗体包被甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液。(3)β2微球蛋白校准品，用来与样本比较进行结果计算，购自柏定生物工程（北京）有限公司。胶乳免疫比浊法测定人体体液(包括血清和羊水)中β2微球蛋白含量的试剂盒包括R1试剂、R2试剂和β2微球蛋白校准品，所述R1试剂和R2试剂均含有电解质氯化铵，促凝剂PEG-800，稳定剂海藻酸丙二醇酯，表面活性剂蔗糖硬脂酸单酯，防腐剂Proclin300，缓冲液pH6.6柠檬酸缓冲液，并且R2试剂还包含抗人β2微球蛋白抗体包被的甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳，R1和R2试剂包含的组分占其质量百分比为：2.5%-3.0%电解质、3%-5%促凝剂、0.5%-1%稳定剂、0.7%-1.0%表面活性剂、0.05%-0.1%防腐剂及浓度范围为0.1mol/L的缓冲液。本专利技术所用的甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳，直径范围为300nm，浓度为0.5～5mg/mL。本专利技术所述甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳为甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳，其表面修饰有环氧基功能团。本专利技术所用的包被抗体到甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳表面的方法为化学交联法，该方法是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行的，采用表面环氧基修饰的胶乳和抗人β2微球蛋白的多克隆抗体进行反应，反应结束后通过4种30bp长度的寡聚核苷酸进行剩余位点封闭，得到抗体胶乳偶联物。通过环氧基开环直接共价偶联抗体的氨基端，同时环氧基团偶联氨基开环之后会生成一个电中性的亲水羟基，共价偶联抗体的纳米粒子仍然能保持良好的水溶性。附图说明图1三种试剂盒的剂量效应曲线。具体实施方式下面结合附图和实施方式对本专利技术做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本专利技术的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本专利技术技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本专利技术的权利要求保护范围内。实施例1：1.制备β2微球蛋白R1试剂电解质氯化铵，促凝剂PEG-800，稳定剂海藻酸丙二醇酯，表面活性剂蔗糖硬脂酸单酯，防腐剂Proclin300，缓冲液pH6.6柠檬酸缓冲液，R1试剂包含的组分占其质量百分比为：2.5%-3.0%电解质、3%-5%促凝剂、0.5%-1%稳定剂、0.7%-1.0%表面活性剂、0.05%-0.1%防腐剂及浓度范围为0.1mol/L的缓冲液，即为R1试剂。2.抗体包被的胶乳的制备选用兔抗人β2微球蛋白抗体和甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳进行偶联，偶联后采用30个碱基的核酸片段进行胶乳活性位点的封闭。将购买的表面环氧基化的甲基丙烯酸环氧丙脂胶乳颗粒加入到相应的抗β2微球蛋白的抗体稀释溶液（10μg/mL,0.5～1.0%(w)海藻糖，PBS溶液)中，表面环氧基化的胶乳颗粒的用量为每毫升抗体稀释溶液中含有0.3mg，置于4℃放置12h，就可获得共价偶联抗体的胶乳颗粒偶联物。抗β2微球蛋白抗体，可以单克隆抗体和多克隆抗体联合加入，也可以单独加入。称取0.5mgGMA微球和适量抗β2微球蛋白抗体，向装有一定量GMA微球的锥形瓶中分批加入用PBS配成1μg/mL的抗β2微球蛋白单克隆抗体溶液，置锥形瓶于4°C摇床中振荡反应，于25℃下振荡反应数小时。经离心分离后，固体颗粒用PBS溶液洗涤4次，除去游离的抗体，即得抗β2微球蛋白抗体偶联微球。反应过程中通过酶联免疫法测定反应液中残留的抗β2微球蛋白单克隆抗体的质量分数，当抗体质量分数无变化时推断为微球充分与抗体完成偶联反应；反应结束后结合了抗β2微球蛋白抗体的复合微球用1mol/L的30个重复碱基的4种等摩尔的寡聚核苷酸溶液在25℃振荡封闭24h，增强下一步反应中微球表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高线性范围的胶乳增强免疫比浊法测定人β2微球蛋白含量的试剂盒，该试剂盒包括：R1试剂、R2试剂和β2微球蛋白校准品，其特征在于：所述R1试剂和R2 试剂均含有电解质氯化铵，促凝剂PEG-800，稳定剂海藻酸丙二醇酯，表面活性剂蔗糖硬脂酸单酯，防腐剂Proclin300，缓冲液pH6.6柠檬酸缓冲液，并且R2试剂还包含抗人β2微球蛋白抗体包被的甲基丙烯酸环氧丙脂 (GMA)胶乳。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高线性范围的胶乳增强免疫比浊法测定人β2微球蛋白含量的试剂盒，该试剂盒包括：R1试剂、R2试剂和β2微球蛋白校准品，其特征在于：所述R1试剂和R2试剂均含有电解质氯化铵，促凝剂PEG-800，稳定剂海藻酸丙二醇酯，表面活性剂蔗糖硬脂酸单酯，防腐剂Proclin300，缓冲液pH6.6柠檬酸缓冲液，并且R2试剂还包含抗人β2微球蛋白抗体包被的甲基丙烯酸环氧丙脂(GMA)胶乳。


2.如权利要求1所述的R1和R2试剂包含的组分占其质量百分比为：2.5%-3.0%电解质、3%-5%促凝剂、0.5%-1%稳定剂、0.7%-1.0%表面活性剂、0.05%-0.1%防腐剂及浓度范围为0.1mol/L的缓冲液。


3.如权利要求1所述的抗体包被的胶乳制备方法为：采用表面环氧基修饰的胶乳和抗人β2微球蛋白的抗体进行反应，反应结束后通过4种30bp长度的寡聚核苷酸进行剩余位点封闭，得到的偶联物使用上述R1试剂进行一定比例的重悬即可。

【专利技术属性】
技术研发人员：华权高，沈鹤霄，徐春雷，
申请(专利权)人：武汉生之源生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42