一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒制造技术

一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒,包括如下以下组分：包括试剂R1、试剂R2和视黄醇结合蛋白标准品，其中试剂R1为含有样本稀释作用的缓冲液，试剂R2为含有抗体胶乳偶联物的缓冲液，其中胶乳抗体偶联物包括标记有抗人视黄醇结合蛋白抗体白色透明胶乳的大粒径胶乳、含有黑色和白色两种颜色胶乳的小粒径胶乳，大粒径胶乳采用抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体，小粒径胶乳采用抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的混合物进行偶联。

A kit for the detection of retinol binding protein in both urine and serum samples

【技术实现步骤摘要】
一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒。
技术介绍
视黄醇结合蛋白（Retinolbindingprotein，RBP）是在肝脏内合成的一种小分子脂质运载蛋白（分子量为21000道尔顿）。视黄醇结合蛋白在肝脏中合成后将全反式视黄醇（维生素Ａ）转运至上皮组织，为视网膜提供维生素ａ。研究发现RBP不仅存在于视网膜中，在人体血液、尿液及其他体液中也存在有大量的RBP，其含量与巧脏、肾脏的健康情况密切相关。目前，血清RBP的检测是评价肝功能损伤和肾小球滤过功能障碍的早期指标，而尿RBP检测是评价近端肾小管功能障碍的早期标志物。目前，视黄醇结合蛋白的检测方法有酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫透射比浊法、放射免疫法（IRMA）和免疫电泳法等。其中免疫比浊法利用全自动生化分析仪来检测，没有放射源、较环保，而且稳定性、精密度和准确性性能良好，在临床常规检测中有广泛的应用。根据RBP试剂盒的使用调查结果，可以发现已有相当一部分实验室正在(或即将)进行RBP的检测，并以sRBP为主。然后，sRBP在调查中虽然通过率较高，但并不意味着该指标检验质量已满足临床要求，因为靶值±30%的评价标准相对宽松。此外，尚存在同一试剂方法在不同实验室间结果差异在3倍以上的情况。调查用质控品源自人血清，除sRBP以外还含有甲状腺运载蛋白等多种蛋白质，实验室间检测结果差异大可能与试剂方法性能有关如特异性、抗干扰能力等。还有，uRBP的调查结果不理想，即使是以靶值±30%来评价，总体及格率也不及25%。同sRBP一样，同一试剂在不同实验室间结果存在较大差异且更加突出，CV达到123.8%。uRBP质控品源自尿液，除uRBP4以外还添加了不同浓度的清蛋白，试剂生产厂家和实验室考虑是否存在试剂方法特异性、线性和是否受清蛋白干扰的问题。已反映出RBP4检测存在的一些问题，市售sRBP4和uRBP4检测试剂盒都需进行方法学研究，检验质量有待提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题而提供。本专利技术通过以下技术方案实现：一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒,包括如下以下组分：包括试剂R1、试剂R2和视黄醇结合蛋白标准品，试剂R1为含有样本稀释作用的缓冲液，试剂R2为含有抗体胶乳偶联物的缓冲液。其中所述胶乳抗体偶联物包括标记有抗人视黄醇结合蛋白抗体白色透明胶乳的大粒径胶乳以及黑色和白色两种颜色的混合小粒径胶乳，大粒径胶乳采用抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体，小粒径胶乳采用两种可以配对的抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的混合物进行标记。小粒径胶乳包含的白色胶乳和黑色胶乳微粒数比例为（20-5）:1;小粒径胶乳为粒径在50-280nm聚苯乙烯胶乳，小粒径的胶乳占试剂R2的质量分数为0.05-0.15%;大粒径胶乳为粒径在500-900nm的白色透明聚苯乙烯微球，大粒径的胶乳占试剂R2的质量分数为0.15-0.2%;小粒径胶乳包含的白色胶乳和黑色胶乳微粒数比例为10:1;小粒径胶乳优选为粒径在100-180nm聚苯乙烯胶乳;大粒径胶乳为粒径优选为550-750nm聚苯乙烯胶乳。试剂盒的组分优选为：R1组分为：NaCl质量分数为1%、PEG-2000质量分数为7%、鸡卵清蛋白质量分数为0.05%、海藻酸丙二醇酯质量分数为2%、以及pH6.5的0.5MTris-HCl缓冲液；R2组分为R1悬浮的抗体包被胶乳颗粒3%（w/v），其中胶乳颗粒如前面所示。黑色胶乳颗粒购自上海甄准生物科技有限公司。其他胶乳购自捷时雅(上海)商贸有限公司。附图说明图1进口试剂盒和本专利技术试剂盒相关性比较。具体实施方式下面结合附图和实施方式对本专利技术做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本专利技术的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本专利技术技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本专利技术的权利要求保护范围内。实施例1RBP试剂盒制备方法：1.小粒径胶乳偶联抗体：（1）胶乳的活化：称取粒径为150nm的黑色胶乳0.05g，称取同样粒径的白色胶乳0.5g，将两种聚苯乙烯胶乳微球混合后加入到pH7.4的0.1MTris-HCl缓冲液、活化剂（EDC/NHS）加入到缓冲溶液中，室温下混合均匀后振荡反应一段时间，离心，沉淀用PBS洗涂、超声后即得到活化的聚苯乙烯微球，收集上清液用紫外吸收法测定上清液中未反应的抗体蛋白浓度。（2）抗体的偶联：取上述活化的微球溶液及一定浓度的RBP抗体于缓冲溶液中振荡反应数小时后，离心，收集上清液，沉淀用PBS洗络、振荡、超声处理多次后即得到偶联好的免疫微球。（3）封闭：ａ）称取甘氨酸0.1ｇ，溶于8mLPBS中，加入免疫微球，混合后定容至18mL，超声混合均匀，保存溶液中甘氨酸的含量为3.3％（W/V），室温下低速300rpm）揽拌反应１小时。ｂ）量取2mLPBS缓冲蔽称取0.4gBSA，混合均匀后加入到上述溶液中，低速300rpm揽拌1h。离也后向沉淀中加入吐温－PBS缓冲液超声清洗两次，除去上清液。C）向离心后的沉淀中加入BSA-吐温-PBS缓冲液液，超声分散均匀，即得到免疫胶乳。2.大粒径胶乳的抗体偶联：步骤同小粒径胶乳微球的偶联，区别在于步骤1采用1.5g重量的550nm大粒径胶乳进行活化。选择活化剂为EDC／NHS、活化时间为30min、小粒径胶乳混合物:抗体蛋白比例为10:1和大粒径胶乳：抗体蛋白比例为5:1、聚苯乙烯微球粒径为100nm、反应体系为pH6.1的MES缓冲液、反应时间为2h的条件下、PEG6000浓度为2%时，胶乳微球抗体蛋白偶联最适宜。按照以下试剂盒的组分配置R1和R2试剂即可得到RBP检测试剂盒：检测试剂组成：R1组分为：NaCl质量分数为1%、PEG-2000质量分数为7%、鸡卵清蛋白质量分数为0.05%、海藻酸丙二醇酯质量分数为2%、以及pH6.5的0.5MTris-HCl缓冲液；R2组分为R1悬浮的抗体包被胶乳颗粒3%（w/v），其中胶乳颗粒中多克隆抗体偶联的550nm大粒径胶乳：双单克隆抗体混合偶联的150nm小粒径胶乳为5:3，在小粒径胶乳中抗体偶联的黑色胶乳：白色胶乳比例为1:10。对比实施例1检测试剂组成：R1组分为：NaCl质量分数为1%、PEG-2000质量分数为7%、鸡卵清蛋白质量分数为0.05%、海藻酸丙二醇酯质量分数为2%、以及pH6.5的0.5MTris-HCl缓冲液；R2组分为R1悬浮的抗体包被胶乳颗粒3%（w/v），其中胶乳颗粒中多克隆抗体偶联的550nm大粒径胶乳：双单克隆抗体混合偶联的150nm小粒径胶乳为5:3。实验例1RBP试剂盒的使用方法。以日立7180生化仪为例，测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒,包括如下以下组分：包括试剂R1、试剂R2和视黄醇结合蛋白标准品，试剂R1为含有样本稀释作用的缓冲液，试剂R2为含有抗体胶乳偶联物的缓冲液，其特征在于：所述胶乳抗体偶联物包括标记有抗人视黄醇结合蛋白抗体白色透明的大粒径胶乳以及黑色和白色两种颜色的混合小粒径胶乳，大粒径胶乳采用抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体，小粒径胶乳采用两种抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的混合物进行标记。/n

【技术特征摘要】
1.一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒,包括如下以下组分：包括试剂R1、试剂R2和视黄醇结合蛋白标准品，试剂R1为含有样本稀释作用的缓冲液，试剂R2为含有抗体胶乳偶联物的缓冲液，其特征在于：所述胶乳抗体偶联物包括标记有抗人视黄醇结合蛋白抗体白色透明的大粒径胶乳以及黑色和白色两种颜色的混合小粒径胶乳，大粒径胶乳采用抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体，小粒径胶乳采用两种抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的混合物进行标记。


2.根据权利要求1所述的一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于：所述抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体是完整的哺乳动物或者鸟类的完整抗体或者有活性抗体片段以及重组抗体、人源化抗体等。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：小粒径胶乳包含的白色胶乳和黑色胶乳微粒数比例为（20-5）:1。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：小...

【专利技术属性】
技术研发人员：华权高，沈鹤霄，徐春雷，
申请(专利权)人：武汉生之源生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42