非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白含有非洲猪瘟病毒的p72蛋白片段和GCN4片段，所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白能够形成三聚体，具有较好的免疫原性。

The p72 fusion protein of African swine fever virus and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，其发病率高，死亡率可高达100％，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。该病最早在1921年于非洲的肯尼亚国家确认发生，2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行。2018年8月3日，中国确诊首例非洲猪瘟疫情，我国是养猪及猪肉消费大国，生猪出栏量、存栏量以及猪肉消费量均位于全球首位。2005年7月，国际病毒分类委员会(ICTV)最新病毒分类第八次报告中指出，非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175～215nm，基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。非洲猪瘟病毒是由病毒基因组、完成基因早期转录所必须的酶以及一些DNA结合蛋白组成，结构蛋白较多，其中p72是主要的结构蛋白之一，根据p72基因末端一段478bp的核酸序列，非洲猪瘟可分为23个基因型，如Benin97/1为基因I型，MalawiLi20/1为基因VIII型，东非埃塞尔比亚分离株属于基因XXIII型。非洲猪瘟病毒基因组变异频繁，表现出明显的遗传多样性。非洲猪瘟病毒不能够诱导产生中和抗体，因此还没有对血清型进行分类。目前全球尚无非洲猪瘟商品化疫苗，正在研究和曾经研究的疫苗主要有灭活疫苗和减毒活疫苗。传统病毒疫苗可通过病毒灭活和病毒致弱两种方法进行制备。迄今为止，采用多种传统方法制备的ASF灭活疫苗均不能对强毒攻击提供有效的免疫保护。虽然用ASF灭活疫苗免疫后可产生高效价的抗体，但很难检测到中和抗体的存在。Blome等研究表明，即使用新型佐剂PolygenTM或等与ASFV灭活抗原进行配伍，免疫动物后能够诱导产生ASFV特异性抗体，但仍未能提高疫苗的免疫保护效力。这可能是由于产生的ASFV特异性抗体并不具有中和活性。此外，Gómez-Puertas等研究人员也证实在细胞传代过程中，低代次和高代次的ASFV毒株对中和抗体的敏感性存在差异。鉴于现有研究结果，采用传统方法研制有效的ASF灭活疫苗困难很大。减毒活疫苗能够诱导强烈持久的免疫应答，但生物安全是其使用的主要限制因素。减毒活疫苗的毒株来源主要有传代致弱毒株和天然致弱毒株。传代致弱ASFV毒株可经过猪骨髓来源细胞、Vero和COS-1等细胞系传代致弱。传代过程中，ASFV致病力逐渐下降，同时病毒免疫原性和稳定性也随之下降。在西班牙和葡萄牙，使用传代致弱毒株免疫动物后产生了灾难性的后果，免疫动物呈现出肺炎、流产和死亡等副作用，在田间多次感染和异源强毒株存在的条件下，许多免疫动物呈现ASF慢性感染临床症状。传代致弱的ASFV安全性较差且很难提供较好免疫保护。采用天然致弱ASFV毒株免疫动物后可造成诸多副反应，包括肺炎、流产、死亡等。免疫NH/P68毒株后25％～47％的猪呈现慢性感染；免疫OURT88/3后可导致发热、关节肿胀等症状。总之，天然致弱毒株导致的诸多副反应以及存在散毒的可能性等生物安全隐患限制了其在实际生产中的进一步应用。因此，一种改进的非洲猪瘟疫苗是目前市场需要的。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白呈三聚体结构，具有较好的免疫原性。本专利技术的第二目的在于提供一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的制备方法，该方法操作简单，适合大规模生产。本专利技术的第三目的在于提供一种上述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白以及和其相关的生物材料，或上述制备方法的应用。为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白含有非洲猪瘟病毒的p72蛋白片段和GCN4片段，所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白和/或含有编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因。根据本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的制备方法，括在宿主中表达编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因。根据本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、所述基因、所述生物材料或所述制备方法的应用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、所述基因和所述生物材料中的至少一种。根据本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了一种疫苗，该疫苗盒包含所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、所述基因和所述生物材料中的至少一种。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白。该融合蛋白含有非洲猪瘟病毒的p72蛋白片段和GCN4片段。p72蛋白片段抗原性佳，病毒感染后能够产生高滴度的抗p72抗体；GCN4片段的序列为MKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGER，能够促进p72蛋白形成三聚体结构。本专利技术提供的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白通过其中的p72蛋白使该蛋白具有良好的免疫原性，可以作为疫苗的活性物质。同时通过融合GCN4片段使p72蛋白形成三聚体结构，使该融合蛋白的结构更接近天然的p72蛋白，从而进一步提高了融合蛋白的免疫原性，并且使该融合蛋白的免疫机制与天然的p72蛋白更一致。以非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、编码其的基因和与非洲猪瘟病毒p72融合蛋白相关的生物材料作为主要活性物质的疫苗生物学活性高，且能够缓解减毒活疫苗在接种后存在潜伏感染和毒力返强的生物安全问题。由于上述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白具有更接近天然猪瘟病毒p72的三聚体结构，因此将该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白用于检测猪瘟病毒抗体，能够实现充分的模拟天然蛋白从而更好的与抗体结合。同时基于该融合蛋白与天然蛋白结构相似的优点，利用该融合蛋白制备得到的抗体也能够更好的与天然p72蛋白结合，从而用于检测样本中的猪瘟病毒抗原，以及检测猪瘟病毒。同时基于本专利技术提供的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白和天然蛋白结构的相似性，其也能有效的激发机体的免疫反应，以作为疫苗抗原，或抗原的主要或辅助成分。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，含有非洲猪瘟病毒的p72蛋白片段和GCN4片段，所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，含有非洲猪瘟病毒的p72蛋白片段和GCN4片段，所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，其特征在于，所述p72蛋白片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；
优选地，GCN4片段融合于p72蛋白片段的N端；
优选地，p72蛋白片段和GCN4片段通过第一连接肽连接；
优选地，所述第一连接肽的序列如SEQIDNO.3所示。


3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白还含有信号肽；
优选地，信号肽的序列如SEQIDNO.3所示；
优选地，信号肽融合于非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的N端；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白还含有标签；
优选地，所述标签包括StrepⅡ标签和His标签；
优选地，StrepⅡ标签和His标签依次融合于所述p72片段的C端；
优选地，StrepⅡ标签和His标签通过第二连接肽连接；
优选地，所述第二连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白由哺乳动物表达系统表达；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白由CHO细胞表达；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白由CHO-K1细胞表达。


4.根据权利要求1-3任一项所述的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，其特征在于，由N端至C端依次为信号肽、GCN4片段、第一连接肽、p72蛋白片段、StrepⅡ标签、第二连接肽和His标签；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白由SEQIDNO.8所示核苷酸序列表达。


5.编码权利要求1-4任一项所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因；
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因为如SEQIDNO.8所示序列，或为和SEQIDNO.8所示序列90％以上同源性的序列；
优选地，编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因为如SEQIDNO.8所示序列。


6.生物材料，所述生物材料包括表...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，张国庆，潘毅平，李延涛，郭苗苗，孔楚心，
申请(专利权)人：天康生物上海有限公司，天康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31