识别WT1抗原短肽的T细胞受体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种能够以高亲和力特异性结合衍生自WT1抗原短肽RMFPNAPYL的T细胞受体(TCR)，所述抗原短肽RMFPNAPYL可与HLA‑A0201形成复合物并一起被呈递到细胞表面。本发明专利技术还提供了编码所述TCR的核酸分子和包含所述核酸分子的载体，以及用于转导本发明专利技术的TCR的细胞。本发明专利技术还提供了所述TCR、核酸分子、载体以及细胞用于制备治疗肿瘤或其他免疫性疾病的药物的用途。

T cell receptor for recognition of WT1 antigen short peptide and its application

【技术实现步骤摘要】
识别WT1抗原短肽的T细胞受体及其应用
本专利技术涉及能够以高亲和力识别衍生自WT1抗原短肽的TCR。本专利技术还涉及转导上述TCR获得的WT1特异性的T细胞，以及他们在预防和治疗与WT1相关肿瘤中的应用。
技术介绍
T细胞免疫疗法是肿瘤免疫治疗中一种十分重要的方法。通过从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，经过体外克隆和扩增后再回输给病人，能够对放、化疗产生耐受的晚期癌症病人产生良好的临床治疗效果(DudleyMEetal.，Science，2002，298(5594)：850-854)。但由于TIL的分离和培养不仅条件苛刻，为达到临床治疗的细胞数所需的时间长，更主要的是到目前为止，能够成功地分离出TIL的肿瘤组织还非常有限，从而使得TIL在肿瘤临床中的应用受到了限制。T细胞识别肿瘤主要是通过其表面上的T细胞受体(TCellReceptor，TCR)来实现。TCR具有识别肿瘤细胞上人类主要组织相容性复合体(MHC)-抗原肽复合物的能力。TCR由α、β两条肽链形成异质二聚体结构。每条肽链各包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常被视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(frameworkregions)中的3个CDR(互补决定区)，即CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与MHC复合物的结合，其中CDR3由可变区和连接区重组而成，被称为超变区，它直接决定了TCR的抗原特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合物时，CDR3可直接与抗原肽结合。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”，即可变区和恒定区，其中可变区中包含连接区。TCR恒定区的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的公开数据库中找到，如TCR分子α链的恒定区序列为“TRAC”，TCR分子β链的恒定区序列为“TRBC1”或“TRBC2”。此外，TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区，胞质区很短。利用基因转导的方法将能够识别肿瘤细胞的TCR转入病人的免疫T细胞中去，就可以将病人的T细胞改造为对肿瘤有特异性的细胞毒性T细胞(TCR-T)。当将此种基因工程改造的TCR-T送到病人体内时，这些对肿瘤有特异性的TCR-T在遇到肿瘤细胞上的MHC-肽复合物时，就会通过识别而被激活，从而在病人体内扩增，并通过杀伤肿瘤细胞而达到治疗肿瘤的效果。WT1属于肿瘤相关性抗原(TumorAssociatedAntigen，TAA)。WT1是一个胚胎发育过程中的转录因子。在成年人中，WT1在肾足细胞，睾丸，卵巢，乳腺肌上皮细胞和部分来自骨髓的CD34+干细胞中都有一定的表达，但是WT1在正常组织中的表达程度很有限(YangLetal.，Leukemia，2007，21(5)：868-876)。而在大多数白血病中，WT1则明显过度表达(MenssenHDetal.，Leukemia，1995，9(6)：1060-1067；YongASetal.，Leukemia，2008，22(9)：1721-1727)。尤其是在AML和CML的CD34+的干细胞中明显过度表达(SaitoYetal.，SciTranslMed，2010，2(17)：17ra9；GerberJMetal.，AmJHematol，2011；86(1)：31-37)。由于WT1的表达水平与预后结果呈负相关(BergmannLetal.，Blood，1997，90(3)：1217-1225)，所以目前临床上采用WT1作为标志物来监测白血病人的残留疾病(CilloniD&SaglioG.ActaHaematol，2004，112(1-2)：79-84；SchroederTetal.，Blood，2014，124(21)：4661-4662)，并预测白血病的复发(TamakiHetal.，Blood，1996，88(11)：4396-4398)。除了在多种白血病中过度表达外，WT1还在多种实体瘤中也过度表达(NakatsukaS等，ModPathol，2006，19(6)：804-814)。所以有研究指出WT1是肿瘤免疫治疗的优良靶抗原(CheeverMAetal.，ClinCancerRes，2009，15(17)：5323-5337)。WT1在细胞内生成后被降解成小分子多肽，在与MHC分子结合形成复合物后，被呈递到细胞表面。RMFPNAPYL是衍生自WT1抗原的短肽，是治疗WT1相关肿瘤的一个靶标。对于上述这些与WT1相关的恶性肿瘤，传统的疗法是采用放疗和化疗等方法，但都会对病人的正常细胞造成损害。最新的研究表明，利用能够识别RMFPNAPYL抗原肽的TCR-T来对肿瘤进行免疫基因治疗时，它不仅可以克服传统放、化疗的无特异性以及相应的毒副作用，而且通过给病人输入能够识别RMFPNAPYL抗原肽的WT1-TCR-T时，可以使100％的肿瘤病人不再复发(Chapuis等，NatMedicine，2019，25(7)：1064-1072)。这无疑是一个十分喜人的研究成果。该文献报道的TCR是从人白细胞抗原HLA-A2阳性供者的T细胞中分离而来，那么根据免疫学原理，它应该不是一个高亲和力的TCR。这是因为WT1是一个自身抗原，所以为了避免自身免疫疾病，HLA-A2阳性供者体内对WT1具有高亲和力的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)早在胸腺细胞的阴性选择过程中就被删除掉了。这样一来，在供者体内自身的T细胞中，往往只有对WT1这一自身抗原产生耐受而且亲和力较低的WT1-CTL才能存活下来。由于低亲和力的CTL往往具有较差的抗肿瘤活性(Derby等，J.Immunol.2001，166：1690-1697)，因此以T细胞为基础的肿瘤免疫治疗的一个非常重要的目标就是要能够获取对肿瘤抗原具有高亲和力和特异性的CTL(Zeh等，JImmunol.1999，162∶989-994)。美国专利US8697854B2描述了一种非自我限制性或者叫异体限制性CTL的方案来获取高亲和力的CTL。通过采用异体限制性CTL的方案，他们获得了对肿瘤相关性抗原酪氨酸酶有特异性的CTL与高亲和力的TCR。该技术的原理是基于采用自身的MHC-肽复合物来刺激异体的CTL，由于来自异体的CTL并未经过自身MHC的阴性选择过程，因而它们含有对自身MHC高度敏感的CTL与高亲和力的TCR。但该方案也有一个明显的缺点就是在对自身的MHC-肽复合物产生免疫应答的T细胞中，只有一小部分是既受MHC的限制，又对抗原肽有特异性，而往往大部分的细胞是只识别了MHC，而不具备对抗原肽的特异性。也就是说用此方法刺激出来的CTL，其中大多数是非特异性的T细胞。如果用这样的CTL来治疗肿瘤，则它们会引起严重的非特异性免疫反应。因此，仍然需要寻找其他对肿瘤抗原WT1既有高亲和力又具特异性的CTL，进而分离并获取对肿瘤抗原具有高亲和力和特异性的TCR。
技术实现思路
为了获得既受MHC的限制，又对抗原肽有特异性的那一小部分有益的CTL，我们对在刺激过程中产生免疫应答的混合T细胞进行单细胞克隆。由于培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述T细胞受体能够以高亲和力与RMFPNAPYL-HLA-A0201复合物结合，所述的TCR包含TCRα链可变区和TCRβ链可变区，所述TCRα链可变区包含三个互补决定区(CDR)，其序列为SEQ ID NO：2-4；所述TCRβ链可变区包含三个互补决定区(CDR)，其序列为SEQ ID NO：5-7。/n

【技术特征摘要】
1.一种T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述T细胞受体能够以高亲和力与RMFPNAPYL-HLA-A0201复合物结合，所述的TCR包含TCRα链可变区和TCRβ链可变区，所述TCRα链可变区包含三个互补决定区(CDR)，其序列为SEQIDNO：2-4；所述TCRβ链可变区包含三个互补决定区(CDR)，其序列为SEQIDNO：5-7。


2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR为αβ异质二聚体，其还包含TCRα链恒定区(TRAC)和TCRβ链恒定区(TRBC1和/或TRBC2)；优选地，所述TCR的α链氨基酸序列为SEQIDNO：10，所述TCR的β链氨基酸序列为SEQIDNO：14。


3.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR为单链；优选地，所述TCR的α链可变区氨基酸序列为SEQIDNO：26和/或所述TCR的β链可变区氨基酸序列包含SEQIDNO：28；更优选地，所述TCR是由α链可变区与β链可变区通过连接肽链SEQIDNO：32连接而成，所述TCR的氨基酸序列为SEQIDNO：30。


4.一种多价TCR复合物，其特征在于，包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为权利要求1-3中任一项所述的TCR。


5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-3中任一项所述的TCR的核苷酸序列或其互补序列，或权利要求1-3中任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛少安，聂苏秦，
申请(专利权)人：陕西九州新药评价研究有限公司西安新药评价研究中心，
类型：发明
国别省市：陕西;61