血液恶性肿瘤的治疗制造技术

提供了新型的核酸序列、载体、修饰的细胞、肽和药物组合物，其可用于治疗患有ΔNPM1阳性血液恶性肿瘤的人受试者。还提供了相应的方法和用途。

Treatment of hematological malignancies

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血液恶性肿瘤的治疗
本专利技术提供了新型的核酸序列、载体、修饰的细胞、肽和药物组合物，其可用于治疗患ΔNPM阳性血液恶性肿瘤的人受试者。还提供了相应的方法和用途。
技术介绍
血液恶性肿瘤是影响血液和淋巴系统的癌症。所述癌症可能始于血液形成组织(例如骨髓)或免疫系统的细胞。血液恶性肿瘤的例子包括骨髓性恶性肿瘤，例如急性骨髓性白血病(AML)。急性骨髓性白血病是骨髓的恶性疾病，其特征在于在分化中聚集的髓性前体细胞的积累。目前，标准治疗包括诱导化疗，然后强化巩固化疗或高剂量治疗与自体或异体造血干细胞移植(alloSCT)相结合，最终≤65岁患者的5年生存率为40-45％，而>65岁患者的5年生存率仅为10％。1-2AlloSCT与低复发率相关，但是这种益处受到高毒性的限制。因此，alloSCT的治疗仅限于状态良好的患者，但由于化疗后的不良的细胞遗传学或分子异常或可检测到的持续性或复发性疾病，预后较差。在大多数患者中，复发在开始化疗后的3年内发生，表明迫切需要高效的且无毒性或毒性有限的新的靶向治疗，以治疗患有AML的患者并提高其生存率。2在过去的几十年中，AML的分子表征已加速。全基因组和外显子组测序表明，AML具有低突变负荷，每位患者平均有13个编码突变。对于具有高突变负荷的癌症类型(例如黑色素瘤和肺癌)，已显示一小部分的体细胞突变编码新抗原。3新抗原是由肿瘤特异性DNA突变产生的肽，当在肿瘤细胞上发生HLA时，可以被特异性T细胞识别。这些抗原的形成是概率性过程，其中每个额外的突变增加产生新抗原的机会。由于AML中的突变负荷低，因此新抗原的数量有望受到限制。3在使用检查点抑制剂进行治疗或体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继转移后，新抗原可在体内充当癌症排斥抗原。3-4检查点抑制剂是能阻断CTLA-4(易普利姆玛(ipilimumab))或PD-1(帕博利珠单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab))介导的T细胞抑制信号的抗体，从而刺激免疫系统靶向新抗原。检查点抑制剂和TIL疗法已经证明对于具有高突变负荷的肿瘤是成功的，但是对于具有低突变负荷的肿瘤是无效的。但是，尽管AML的总体突变负荷低，但是体细胞异常通常发生在有限数量的驱动基因中，这些基因在多位患者中反复发生突变。5结果，AML中反复突变产生的新抗原与靶向免疫治疗的开发相关。需要新的免疫疗法来治疗血液恶性肿瘤，包括例如AML的骨髓性恶性肿瘤。
技术实现思路
专利技术人已经认识到，核磷蛋白的突变形式(ΔNPM1或NPM1mut)是例如髓样恶性肿瘤(特别是AML)的血液恶性肿瘤的免疫疗法的理想靶标，因为突变蛋白的形成限于恶性造血细胞。核磷蛋白(NPM1)是一种驱动基因，其在大约30％的AML患者中经常发生突变。5在其他类型的血液恶性肿瘤(例如其他骨髓性恶性肿瘤)中也观察到了突变的NPM1，尽管在AML以外的肿瘤中的频率要低得多。具有突变的NPM1(ΔNPM1或NPM1mut)的患者在基因的外显子12中携带特征性4个碱基对(4-bp)移码插入。所得的ΔNPM1蛋白比野生型配对物长4个氨基酸(AA)，并且其C末端11个AA是在可变阅读框(CLAVEEVSLRK)中翻译的。结果，ΔNPM1蛋白从核仁(在那里作为核质穿梭蛋白起作用)向细胞质脱位。6因此，ΔNPM1蛋白位于细胞内。但是，HLA限制的ΔNPM1衍生肽在细胞表面可被T细胞受体访问，因此可以被T细胞识别。通过研究原发性AML的HLAI类配体组，专利技术人确定了由HLAI类呈递的ΔNPM1选择阅读框编码的5种肽。所述5种鉴定的肽是CLAVEEVSL(SEQIDNO：1)、AVEEVSLRK(SEQIDNO：26)、CLAVEEVSLRK(SEQIDNO：27)、VEEVSLRK(SEQIDNO：28)和AVEEVSLR(SEQIDNO：29)。这些肽可用作治疗剂(例如疫苗)，以治疗或预防ΔNPM1阳性AML23。或者，它们可以用作靶抗原，用于治疗具有本文所述修饰细胞的这类患者(例如具有特异性识别所述肽之一的T细胞受体的外周血淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))。有利地，表达对选自CLAVEEVSL(SEQIDNO：1)、AVEEVSLRK(SEQIDNO：26)、CLAVEEVSLRK(SEQIDNO：27)、VEEVSLRK(SEQIDNO：28)和AVEEVSLR(SEQIDNO：29)的肽特异的TCR的T细胞可用作治疗ΔNPM1阳性AML的有效免疫疗法。因此，使用这些肽特异性TCR的TCR基因转导方法可为ΔNPM1阳性AML患者带来新的治疗方式。专利技术人首次表明，CLAVEEVSL存在于从HLA-A*02:01阳性AML患者中分离出的原发性AML细胞的表面上。有利地，所述肽因此可以用作治疗或预防HLA-A*02:01阳性人类患者中ΔNPM1阳性AML的治疗剂(例如疫苗)。或者，它可以用作靶抗原，用于治疗具有本文所述修饰细胞的这类患者(例如具有特异性识别CLAVEEVSL的T细胞受体的外周血淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))。为了研究在HLA-A*02:01的情况下存在的具有特异于CLAVEEVSL的T细胞受体(TCR)的T细胞是否存在于健康个体的T细胞库中，针对CLAVEEVSL及其半胱氨酰化变体产生了HLA-A*02:01四聚体，并将四聚体阳性CD8T细胞与健康个体的外周血单个核细胞(PBMC)分离。测试了几种四聚体阳性T细胞克隆，只有两种显示出与CLAVEEVSL的特异性结合以及HLA-A*02:01和ΔNPM1阳性AML的识别。对最具反应性的克隆(1A2)的T细胞受体进行测序，并将其引入CD8+和CD4+T细胞，这证明了具有ΔNPM1的HLA-A*02:01阳性原发性AML的特异性识别和裂解是通过共受体独立方式进行的。因此，本专利技术人已经鉴定了特异性结合新抗原CLAVEEVSL的TCR。有利地，表达对CLAVEEVSL特异的TCR的T细胞因此可以用作治疗具有ΔNPM1阳性AML的HLA-A*02:01阳性患者的有效免疫疗法。因此，使用CLAVEEVSL特异的TCR的TCR基因转导方法可以为ΔNPM1阳性AML的HLA-A*02:01阳性患者带来新的治疗方式。此外，所述肽CLAVEEVSL(特别是其半胱氨酰化形式，即C*LAVEEVSL)因此可以用作治疗剂(例如疫苗)，以治疗或预防HLA-A*02:01阳性患者中ΔNPM1阳性AML。因此，该肽本身也具有效用，例如以分离的形式，或当配制成药物组合物时。通过研究原发性AML的HLAI类配体组，专利技术人还鉴定了由ΔNPM1的可变阅读框(分别为AVEEVSLRK和CLAVEEVSLRK)编码的不同的9聚体肽和11聚体肽。AVEEVSLRK和CLAVEEVSLRK中的每一个与HLA-A*03:01和HLA-A*11:01的结合通过用于四聚体生产的单体折叠来证实(如本文对CLAVEEVSL肽的详细描述)。因此，AVEEVSLRK和CLAVEEVSLRK肽中的每一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的核酸序列，其编码：/n(a)包含TCRα链多肽的CDR3的多肽，所述多肽特异性结合选自CLAVEEVSL(SEQ ID NO：1)、AVEEVSLRK(SEQ ID NO：26)、CLAVEEVSLRK(SEQ ID NO：27)、VEEVSLRK(SEQ ID NO：NO：28)和AVEEVSLR(SEQ ID NO：29)的肽；和/或/n(b)包含TCRβ链多肽的CDR3的多肽，所述多肽特异性结合选自CLAVEEVSL(SEQ ID NO：1)、AVEEVSLRK(SEQ ID NO：26)、CLAVEEVSLRK(SEQ ID NO：27)、VEEVSLRK(SEQ ID NO：NO：28)和AVEEVSLR(SEQ ID NO：29)的肽。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 NL 2019156;20180316 NL 20206021.一种分离的核酸序列，其编码：
(a)包含TCRα链多肽的CDR3的多肽，所述多肽特异性结合选自CLAVEEVSL(SEQIDNO：1)、AVEEVSLRK(SEQIDNO：26)、CLAVEEVSLRK(SEQIDNO：27)、VEEVSLRK(SEQIDNO：NO：28)和AVEEVSLR(SEQIDNO：29)的肽；和/或
(b)包含TCRβ链多肽的CDR3的多肽，所述多肽特异性结合选自CLAVEEVSL(SEQIDNO：1)、AVEEVSLRK(SEQIDNO：26)、CLAVEEVSLRK(SEQIDNO：27)、VEEVSLRK(SEQIDNO：NO：28)和AVEEVSLR(SEQIDNO：29)的肽。


2.根据权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述核酸序列编码(a)和(b)两者，其中(a)和(b)一起特异性结合选自CLAVEEVSL(SEQIDNO：1)、AVEEVSLRK(SEQIDNO：26)、CLAVEEVSLRK(SEQIDNO：27)、VEEVSLRK(SEQIDNO：28)和AVEEVSLR(SEQIDNO：29)的肽。


3.根据前述权利要求的任一项所述的分离的核酸序列，其中所述编码的多肽与CLAVEEVSL(SEQIDNO：1)特异性结合。


4.根据权利要求3所述的分离的核酸序列，其中(a)的CDR3具有与CAVTGARLMF(SEQIDNO：2)具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


5.根据权利要求4所述的分离的核酸序列，其中(a)的CDR3由SEQIDNO：3或SEQIDNO：4的核酸序列编码。


6.根据权利要求3-5的任一项所述的分离的核酸序列，其中(b)的CDR3具有与CASSPGGLSNEQF(SEQIDNO：5)具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


7.根据权利要求4所述的分离的核酸序列，其中(b)的CDR3由SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的核酸序列编码。


8.根据权利要求3-7的任一项所述的分离的核酸序列，其中(a)的CDR3在特异性结合SEQIDNO：1的TCRα链可变区之内，任选地其中(a)进一步包含TCRα链恒定区。


9.根据权利要求8所述的分离的核酸序列，其中所述TCRα链可变区具有与SEQIDNO：8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


10.根据权利要求9所述的分离的核酸序列，其中(a)的TCRα链可变区由SEQIDNO：9或SEQIDNO：10的核酸序列编码。


11.根据权利要求3-10的任一项所述的分离的核酸序列，其中(b)的CDR3在特异性结合SEQIDNO：1的TCRβ链可变区之内，任选地其中(b)进一步包含TCRβ链恒定区。


12.根据权利要求11所述的分离的核酸序列，其中所述TCRβ链可变区具有与SEQIDNO：11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


13.根据权利要求12所述的分离的核酸序列，其中(b)的TCRβ链可变区由SEQIDNO：12或SEQIDNO：13的核酸序列编码。


14.根据权利要求3-13的任一项所述的分离的核酸序列，其中(a)的CDR3在与SEQIDNO：8具有至少90％序列同一性的TCRα链可变区之内，其中所述CDR3具有SEQIDNO：2的氨基酸序列；并且任选地其中(a)包含TCRα链恒定区。


15.根据权利要求14所述的分离的核酸序列，其中TCRα链可变区CDR1具有SEQIDNO：14的氨基酸序列并且TCRα链可变区CDR2具有SEQIDNO：15的氨基酸序列。


16.根据权利要求3-15的任一项所述的分离的核酸序列，其中(b)的CDR3在与SEQIDNO：11具有至少90％序列同一性的TCRβ可变区之内，其中所述CDR3具有SEQIDNO：5的氨基酸序列；并且任选地其中(b)包含TCRβ链恒定区。


17.根据权利要求16所述的分离的核酸序列，其中TCRβ链可变区CDR1具有SEQIDNO：16的氨基酸序列并且TCRβ链可变区CDR2具有SEQIDNO：17的氨基酸序列。


18.根据前述权利要求的任一项所述的分离的核酸序列，其中所述肽CLAVEEVSL(SEQIDNO：1)是半胱氨酰化的(cysteinylated)。


19.根据前述权利要求的任一项所述的分离的核酸序列，其中所述核酸序列编码T细胞受体。


20.一种载体，其包含权利要求1-19的任一项所述的核酸序列。


21.根据权利要求20所述的载体，其中所述载体是质粒或病毒载体，任选地其中所述载体选自由以下组成的组：逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、疱疹病毒、微环载体和合成DNA或RNA。


22.用根据权利要求1-19的任一项所述的核酸序列或根据权利要求20或21所述的载体转染或转导的修饰的细胞。


23.根据权利要求22所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞选自由以下组成的组：CD8T细胞、CD4T细胞、NK细胞、NKT细胞、γ-δT细胞、造血干细胞、祖细胞、T细胞系或NK-92细胞系。


24.根据权利要求22或23所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是人细胞。


25.一种分离的肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
(i)CLAVEEVSL(SEQIDNO：1)，其中半胱氨酸氨基酸是半胱氨酰化的；
(ii)AVEEVSLRK(SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：玛丽·格里芬，J·H·弗雷德里克·福尔肯伯格，
申请(专利权)人：莱顿大学医学中心附属莱顿教学医院，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL