一种Mcl-1小分子荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种Mcl‑1小分子荧光探针和其制备方法和应用，所属化合物结构如通式Ⅰ所示。本发明专利技术的探针结构新颖，对Mcl‑1蛋白的结合亲和力强，具有良好的荧光特性，且反应时间快、专属性强，可以特异性识别且定量测定Mcl‑1蛋白。本发明专利技术的探针可以实现Mcl‑1蛋白抑制剂的高通量筛选及在制备用于检测抑制Mcl‑1蛋白试剂中的应用。本发明专利技术的荧光探针可以用于Mcl‑1蛋白高表达的肿瘤细胞的标记。本发明专利技术探针原料便宜易得，反应步骤简单，后处理过程简便。

A Mcl-1 small molecule fluorescence probe and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种Mcl-1小分子荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及药物
，具体涉及Mcl-1小分子荧光探针及其制备方法，及其在Mcl-1蛋白特异定量检测、Mcl-1抑制剂活性筛选、细胞毒性评价及细胞成像中的应用。
技术介绍
细胞凋亡(程序性细胞死亡)是一个保守进化的细胞过程，对胚胎的发育和组织稳态起着非常重要的作用。细胞凋亡功能的异常会导致多种人类疾病的发生，包括神经退行性疾病，自身免疫性疾病和癌症等等。因此，通过调节凋亡途径中的关键蛋白进而调节细胞凋亡可能是癌症有效的治疗方法。细胞凋亡主要包括外源性通路与内源性线粒体通路两种途径。在线粒体介导的内源性凋亡通路中，Bcl-2家族蛋白可通过靶向线粒体外膜，以改变其线粒体外膜的通透性，然后释放细胞色素c，激活细胞凋亡蛋白酶，最终导致细胞死亡。Bcl-2家族由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白组成。对于促凋亡蛋白，可进一步分为多结构域蛋白质(例如，BAX，BAk，Bcl-Xs和BAK)和BH3-only蛋白质(例如BIM，BID，BAD，PUMA和NOXA)。BAK和BAX可诱导细胞色素c释放。BH3-only蛋白质促进BAX和BAK的动态激活。抗凋亡蛋白成员，如Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w和Mcl-1蛋白，通常共享四个BH域(BH1-4)。它们与促凋亡蛋白相结合，防止BAX和BAK之间的结合相互作用，促进细胞存活。抗凋亡蛋白的过度表达，使得肿瘤细胞可以逃避凋亡的生理过程，进而获得生存优势。作为抗凋亡蛋白家族的重要成员，Mcl-1蛋白过表达可导致癌变细胞无法发生凋亡，从而影响肿瘤的治疗效果，产生耐药性。因此，针对Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员的抑制剂研究已经成为近年来抗肿瘤药物的研究热点。Mcl-1蛋白过表达在多种癌症细胞中均可以被监测，包括乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌和宫颈癌以及白血病和黑色素瘤等，成为癌细胞抵抗常规化疗药物的重要作用机制。因此，有效的Mcl-1抑制剂和抗细胞凋亡机制的进一步研究是非常有必要的。为了更好地分析Mcl-1的抗细胞凋亡机制，制定癌症治疗策略，小分子荧光探针可以最低限度地影响天然Mcl-1蛋白的性质，为检测肿瘤细胞提供了广泛的应用。目前，小分子荧光探针，由于其独特的优势，包括低成本，高灵敏度，操作步骤简单，被广泛地应用于蛋白质、核酸等重要生物分子的生物学和药理学检测中，对疾病机制探讨、临床诊断及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。然而，目前的Mcl-1蛋白荧光探针数量非常少，且存在选择性差、灵敏度低以及荧光背景干扰大等问题，因此，开发新型的Mcl-1蛋白小分子荧光探针是非常有意义的。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种Mcl-1小分子荧光探针及其制备方法、光学活性、生物活和在制药领域中的应用。具体技术方案如下：一、Mcl-1小分子荧光探针一种Mcl-1小分子荧光探针，具有下述结构通式Ⅰ所示的结构：其中，R1为磺酰氯类荧光团，R2为羧基或四氮唑。优选地，所述R1为丹磺酰氯，喹啉磺酰氯，10-乙基-吖啶酮-2-磺酰氯，4-(N-苯并吡咯酮)-苯磺酰氯荧光团；R2为羧基。更优选地，Mcl-1小分子荧光探针选自具有以下结构式DNSH的化合物：二、Mcl-1小分子荧光探针的制备方法Mcl-1小分子荧光探针的制备方法以化合物DNSH为例，其反应过程如下：具体步骤为：(1)4-氨基-1-萘酚和丹磺酰氯在二氯甲烷和三乙胺的条件下生成中间体3；(2)步骤(1)所得中间体3在高碘酸钠环境下进行氧化得中间体4；(3)步骤(2)所得中间体4与巯基乙酸在DMF溶液中发生加成反应，得到终产物探针分子DNSH。三、Mcl-1小分子荧光探针的应用本专利技术的Mcl-1小分子荧光探针可以作为特异性识别且定量测定Mcl-1蛋白的探针。本专利技术的Mcl-1小分子荧光探针可以实现Mcl-1蛋白抑制剂的高通量筛选及在制备用于检测抑制Mcl-1蛋白试剂中的应用。本专利技术的Mcl-1小分子荧光探针可以用于Mcl-1蛋白高表达的肿瘤细胞的标记。本专利技术的Mcl-1小分子荧光探针在制备筛选Mcl-1蛋白相关疾病的药物制剂中的应用，所述的相关疾病为恶性肿瘤；优选的，所述Mcl-1蛋白过表达相关恶性肿瘤为胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤以及白血病。本专利技术的有益效果：1.本专利技术的探针结构新颖，对Mcl-1蛋白的结合亲和力强。探针的斯托克位移较大，且对周围环境的变化较为敏感，表明探针具有良好的荧光特性，且反应时间快、专属性强。2.本专利技术的探针DNSH可以特异性识别且定量测定Mcl-1蛋白。本专利技术的探针可以实现Mcl-1蛋白抑制剂的高通量筛选及在制备用于检测抑制Mcl-1蛋白试剂中的应用。本专利技术的荧光探针可以用于Mcl-1蛋白高表达的肿瘤细胞的标记。本专利技术的Mcl-1小分子荧光探针在制备筛选Mcl-1蛋白相关疾病的药物制剂中的应用，所述的相关疾病为恶性肿瘤；优选的，所述Mcl-1蛋白过表达相关恶性肿瘤为胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤以及白血病。3.本专利技术探针原料便宜易得，反应步骤简单，后处理过程简便。附图说明图1为(A)探针DNSH的吸收光谱(B)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光激发光谱(C)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光发射光谱(D)不同的溶剂中探针的荧光激发光谱(E)不同溶剂中探针的荧光发射光谱。图2为探针DNSH对Mcl-1蛋白荧光特异性鉴别实验。(A)室温下5μM的荧光探针与不同浓度的Mcl-1蛋白(0.45,0.3,0.225,0.1125and0mg/mL)在缓冲溶液中孵育20min后的荧光发射光谱。(B)495nm处的荧光强度与Mcl-1蛋白浓度的线性关系图。(C)5μM的荧光探针与5μM的荧光探针和0.225mg/mL的Mcl-1蛋白在室温下孵育后每两分钟测定的495nm处的荧光强度。(D)室温下5μM的荧光探针、5μM的荧光探针和0.225mg/mL的Mcl-1蛋白、5μM的荧光探针和0.225mg/mL的Mcl-1蛋白和5μM蛋白抑制剂UMI-77、5μM的荧光探针和0.225mg/mL的Mcl-1蛋白和100μM蛋白抑制剂UMI-77在缓冲溶液中孵育的荧光发射光谱。(E)室温下5μM的荧光探针与0.225mg/mL的Mcl-1蛋白、Bcl-2蛋白以及BSA蛋白在缓冲溶液中孵育的荧光发射光谱。(F)室温下5μM的荧光探针与0.225mg/mL的Mcl-1蛋白、Bcl-2蛋白以及BSA蛋白在缓冲溶液中孵育后495nm处的荧光强度柱状图。图3为5μM探针分子DNSH在PC-3和HUVEC细胞有无抑制剂UMI-77(100μM)存在条件下的成像(A：HUVEC细胞B、C：PC-3细胞；A1、B1、C1：明场；A2、B2、C2：绿色荧光蛋白通道)镜头的放大倍数:63×。...

【技术保护点】
1.一种Mcl-1小分子荧光探针，其特征在于，具有下述结构通式Ⅰ所示的结构：/n

【技术特征摘要】
1.一种Mcl-1小分子荧光探针，其特征在于，具有下述结构通式Ⅰ所示的结构：



其中，R1为磺酰氯类荧光团，R2为羧基或四氮唑。


2.如权利要求1所述的Mcl-1小分子荧光探针，其特征在于，所述R1为丹磺酰氯，喹啉磺酰氯，10-乙基-吖啶酮-2-磺酰氯，4-(N-苯并吡咯酮)-苯磺酰氯荧光团；R2为羧基。


3.如权利要求2所述的Mcl-1小分子荧光探针，其特征在于，Mcl-1小分子荧光探针选自具有以下结构式DNSH的化合物。





4.如权利要求3所述的Mcl-1小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)4-氨基-1-萘酚和丹磺酰氯在二氯甲烷和三乙胺的条件下生成中间体3；



(2)步骤(1)所得中间体3在高碘酸钠环境下进行氧化得中间体4；



(3)步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：方浩，李佳，杨新颖，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37