人TPT1/TCTP基因在制备抗肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术人TPT1/TCTP基因在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术构建了人TPT1/TCTP基因小分子干扰RNA、人TPT1/TCTP基因干扰核酸构建体、人TPT1/TCTP基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明专利技术提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人TPT1/TCTP基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中TPT1/TCTP基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Application of human TPT1 / TCTP gene in the preparation of antitumor drugs

【技术实现步骤摘要】
人TPT1/TCTP基因在制备抗肿瘤药物中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及人TPT1/TCTP基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
肿瘤翻译控制蛋白（TPT1或TCTP）是一个生长相关的蛋白质，有促进生长、抗凋亡的作用，阻断该蛋白表达能抑制肿瘤细胞株的恶性表型。TPT1/TCTP基因与其他甲状腺癌、胸腺瘤之间的关联尚无相关报道。现有技术中使用方法类似基因构建了人基因小分子干扰RNA、人基因干扰核酸构建体、人基因干扰慢病毒并公开了它们的用途。提供siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。本专利技术深入研究TPT1/TCTP基因在肿瘤发生中的调节功能，甲状腺癌、胸腺瘤细胞模型，以RNAi为手段研究TPT1/TCTP在甲状腺癌、胸腺瘤发生和发展中的作用。核糖核酸干扰(RNAinterference，RNAi)作为一种基因沉默技术，可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失。目前，该技术在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研发等方面已经显示出广阔前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供人TPT1/TCTP基因在制备抗肿瘤药物中的应用。为实现上述目的采用以下技术方案：本专利技术以RNA干扰为手段，研究了TPT1/TCTP基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制TPT1/TCTP基因的转录或翻译，或能够特异性抑制TPT1/TCTP蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。所述肿瘤细胞选自甲状腺癌、胸腺瘤之任一。从Genbank中调取人TPT1/TCTP基因序列；预测多个siRNA位点；合成针对TPT1/TCTP基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNAOligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNAOligo连接，构建表达TPT1/TCTP基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，选取胸腺瘤和甲状腺癌细胞系，慢病毒进行侵染，qpcr检测TPT1/TCTP基因的沉默效率，筛选高效沉默TPT1/TCTP基因的慢病毒。MTT法检测TPT1/TCTP沉默后胸腺瘤和甲状腺癌细胞的增殖能力。本专利技术的优点在于：本专利技术公开了人TPT1/TCTP基因的用途及其相关药物。还公开了人TPT1/TCTP基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本专利技术还进一步构建了人TPT1/TCTP基因小分子干扰RNA、人TPT1/TCTP基因干扰核酸构建体、人TPT1/TCTP基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本专利技术提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人TPT1/TCTP基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中TPT1/TCTP基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。附图说明图1人甲状腺癌细胞FTC-133细胞TPT1/TCTP基因干扰效率鉴定。图2胸腺瘤细胞Thy0517细胞TPT1/TCTP基因干扰效率鉴定。图3TPT1/TCTP基因干扰后对人甲状腺癌细胞FTC-133细胞增殖能力的影响。图4TPT1/TCTP基因干扰后对胸腺瘤细胞Thy0517细胞增殖能力的影响。图5TPT1/TCTP基因干扰后对人甲状腺癌细胞FTC-133细胞凋亡水平的影响。图6TPT1/TCTP基因干扰后对胸腺瘤细胞Thy0517细胞凋亡水平的影响。具体实施方式实施例1TPT1慢病毒载体的构建和稳转细胞株的建立1、siRNA靶点设计登录美国国立生物信息中心（NCBI）查询人TPT1（NM_001286272.1）的碱基序列，利用DSIR软件针对编码序列区域设计出12对有效的siRNA靶点。2、pLVX-shRNA2-Puro-TPT1及阴性对照pLVX-shRNA2-Puro-NC质粒构建根据上述siRNA序列(以SEQIDNO：1,2,3为例)，设计相应互补的单链DNA，两端加BamHI和EcoRI酶切位点。退火:将单链的shRNA上下游片段进行退火，形成双链DNA片段，随后连接至酶切后的载体上。退火反应体系：扩增程序：95℃,5min；室温冷却1-2h。3.干扰载体双酶切回收1）pLVX-shRNA2-Puro载体酶切体系：2）pLVX-shRNA2-Puro载体酶切条件：37℃,2-3h。3）琼脂糖凝胶鉴定，切胶回收。4）连接由于shRNA片段已带有酶切后的粘性末端，故可直接与酶切后的载体进行连接。酶切后的载体和基因连接。以下试剂混合后于16℃连接过夜。连接体系如下（10μl）：5）转化（1）将感受态细胞Stbl3从-80℃冰箱取出，迅速放入冰上，静置5min融化。（2）加入上述连接体系至感受态中轻轻震荡混匀，再置于冰上冰浴30min；（3）将上述混合物置42℃水浴锅内水浴90s进行热休克，迅速转移到冰上，开始计时放置3min；（4）加入无抗性LB液体培养基900μL，恒温摇床温度设定37℃，转速200r/min，培养0.5-1h；（5）取已铺好的固体LB-AMP培养皿，取100μL悬浮的菌液用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀涂布，37℃恒温培养箱内倒置培养过夜。6）鉴定阳性克隆：挑菌PCR：测序及比对序列。序列比对正确的克隆即为构建成功的载体。4、慢病毒包装10cm口径培养皿培养人胚肾细胞293T细胞。待细胞密度达到70%-80%时转染，使用RRE、REV、VSV/G慢病毒包装质粒系统，从培养箱中取出293T细胞（(H)DMEM+5%FBS培养）培养皿，更换培养基，按照Lipofectamine3000说明书进行操作将质粒混合液加入293T细胞培养皿中，分别于24小时、48小时和72小时收集细胞上清。慢病毒包装体系：混合三次收集的细胞上清液于4℃，3000g条件下离心25min，使细胞碎屑沉淀，0.45μm微孔滤膜过滤上清液于超速离心管中，配平，离心30000g，90min。倒掉上清液，用200μlPBS溶液充分溶解管底病毒，枪头吹打数次，分装后迅速放置于-80℃冰箱长期保存。5、qpcr检测甲状腺癌细胞和胸腺瘤细胞TPT1干扰效率稳定低表达的细胞株建立：人甲状腺癌细胞FTC-133细胞及胸腺瘤细胞Thy0517细胞接种于6孔板中。待细胞密度达到60%时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人TPT1/TCTP基因在制备抗肿瘤药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.人TPT1/TCTP基因在制备抗肿瘤药物中的应用。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王巧文，邱德辉，谢翔峰，
申请(专利权)人：福州载基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35