长链非编码RNA GAS5在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了长链非编码RNA GAS5在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。研究结果表明通过下调或者抑制机体GAS5的表达，能够促进背根节DRG神经元轴突再生，进而有利于周围神经损伤修复。

【技术实现步骤摘要】
长链非编码RNAGAS5在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用
本专利技术属于神经再生和修复
，具体涉及长链非编码RNAGAS5在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。
技术介绍
坐骨神经损伤是常见的研究周围神经再生的模型，研究发现预先给予坐骨神经条件性损伤(挤压或切断)能激活L4～L6背根神经节(dorsalrootganglia,DRG)中神经元的再生潜能，加速其在体内、外的生长。要实现成功的神经再生，根本途径在于确保神经元存活及激活神经元内在的再生能力，提高轴突生长的速度。目前已证实的损伤刺激信号包括正调控的丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、白血病抑制因子(LIF)、白介素6(IL-6)；负调控的损伤信号包括TGF-β/Smad2/Smad3等。近年来的研究表明，非编码RNA(non-codingRNA)，包括长链非编码RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)和以microRNA(miRNA)为代表的小RNA，构成复杂的调控网络，在表观遗传、转录及转录后等层面调控基因表达。我们课题组在国际上率先开展非编码RNA在神经再生过程中的作用及机制研究，发现了一些在神经损伤后DRG神经元表型调节中发挥重要作用的miRNAs和lncRNAs。这些研究表明ncRNA参与了神经元存活和再生这两个关键步骤的调控。GAS5(growtharrestspecific5，生长抑制特异基因)是一个抑制肿瘤，促进凋亡的长链非编码RNA。GAS5在多种肿瘤组织中呈低表达，表现为抑癌基因的作用，过表达GAS5可抑制肿瘤生长、侵袭和转移，并诱导细胞凋亡，增强细胞对化疗药物的敏感性。GAS5表达下调常与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。然而GAS5在神经损伤和修复中的作用及其机制还不清楚。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供长链非编码RNAGAS5的一种新的用途，可用于制备促进神经再生和修复神经损伤药物。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供上述长链非编码RNAGAS5在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用，其cDNA序列如SEQIDNo：1所示。优选的，所述神经损伤为周围神经。所述神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。本专利技术所述的应用，长链非编码RNAGAS5可作为靶点，通过抑制/下调GAS5表达，促进神经再生和神经损伤修复。本专利技术所述的应用，可以以长链非编码RNAGAS5作为靶点设计或筛选GAS5的抑制剂，制备促进神经再生和修复神经损伤药物。所述长链非编码RNAGAS5的抑制剂选自小分子化合物、蛋白、多肽、多糖、糖蛋白、糖肽、核酸中的一种或几种。优选的，所述长链非编码RNAGAS5的抑制剂为根据其核苷酸序列设计相应的siRNA，进一步优选所述siRNA核苷酸序列如下所示：siRNA1：正义链5’-CAAUGAUUGGUCAUUCUGA-3’(SEQIDNO：4)；反义链5’-UCAGAAUGACCAAUCUUG-3’(SEQIDNO：5)；siRNA2：正义链5’-GGUCCUUCAUUCUGAAUUU-3’(SEQIDNO：6)；反义链5’-AAAUUCAGAAUGAAGGACC-3’(SEQIDNO：7)；siRNA3：正义链5’-GAAGAUGGUGUCAGAUAUA-3’(SEQIDNO：8)；反义链5’-UAUAUCUGACACCAUCUUC-3’(SEQIDNO：9)；siRNA4：正义链5’-GAUUGGUCAUUCUGAAUUUTT-3’(SEQIDNO：10)；反义链5’-AAAUUCAGAAUGACCAAUCAT-3’(SEQIDNO：11)。本专利技术研究结果表明，GAS5在小鼠坐骨神经损伤后神经再生启动阶段显著上调。核浆分离后的qRT-PCR结果证实GAS5主要分布在神经元的胞浆里。本专利技术设计了体外三条靶向GAS5的siRNA(siRNA1-3)，其中两个siRNA(siRNA1、3)能明显有效抑制GAS5，促进培养的小鼠DRG神经元突起的生长。另外，选择了一条经过化学修饰能进行体内实验的靶向GAS5的siRNA(siRNA4)，将该siRNA注射进小鼠L4～L5DRGs中，2天后夹伤坐骨神经，3天后灌注。qRT-PCR显示体内siRNA4能有效抑制GAS5，经坐骨神经透明化和标记再生神经轴突的SCG10染色，发现抑制小鼠L4～L5DRG中GAS5可以显著促进DRG神经元轴突的再生。本专利技术发现了LncRNAGAS5对神经元轴突再生的调节作用，为神经再生提供新的分子干预靶点。附图说明图1为本实施例所述小鼠坐骨神经损伤后DRG组织中LncRNAGAS5的表达和定位。A.qRT-PCR检测Gas5在坐骨损伤后DRG中的表达。B.qRT-PCR检测DRG神经元细胞中LncRNAGAS5的定位。与U6(主要在细胞核中表达)、GAPDH(主要在细胞质中表达)相比，LncRNAGAS5主要在DRG神经元的细胞质中表达。图2为本实施例所述体外siRNA干扰LncRNAGAS5的表达促进DRG神经元突起的生长。A.体外GAS5siRNA1-3干扰DRG神经元中的GAS5的干扰效果。B.体外GAS5siRNA1-3处理DRG神经元后，TUJ1标记神经元胞体及轴突，bar＝100μm。C.体外GAS5siRNA干扰后，统计大于胞体直径的轴突，计算每组细胞的平均轴突长度。图3为本实施例体内siRNA干扰LncRNAGAS5的表达促进DRG神经元突起的生长。A.体内GAS5siRNA4注射3d后收集DRG神经元，qRT-PCR检测各组GAS5表达情况。B.坐骨神经透明化结合SCG10染色，发现GAS5siRNA4干扰GAS5显著促进体内DRG神经元突起的生长。标尺，1000mm。C.不同再生距离上轴突数量光密度统计。具体实施方式以下通过实施例说明本专利技术的具体步骤，但不受实施例限制。在本专利技术中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1：坐骨神经损伤后DRG组织中GAS5的表达及定位一、DRG组织RNA提取及qRT-PCR成年健康雄性C57BL/6J鼠，体重20g，随机分为5组，每组6只。复合麻醉剂麻醉后，切开左下肢皮肤，暴露左侧平行于股骨中段的坐骨神经，无齿镊夹伤30s，然后缝合皮肤。手术后，在适宜的条件下饲养动物以减轻其疼痛，每天光照12h，自由饮水和进食。大鼠坐骨神经夹伤后0d,3h,9h,1d,4d,7d夹伤侧L4～L6DRG组织按Reagent(Invitrogen)说明书提取组织RNA。逆转录后，采用PrimeScriptRT-PCRKi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.长链非编码RNA GAS5在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用，其cDNA序列如SEQ ID No：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.长链非编码RNAGAS5在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用，其cDNA序列如SEQIDNo：1所示。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述神经为周围神经。


3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述神经损伤为坐骨神经损伤。


4.如权利要求1所述的应用，其特征在于长链非编码RNAGAS5作为靶点，通过抑制/下调GAS5表达，促进神经再生和神经损伤修复。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于以长链非编码RNAGAS5...

【专利技术属性】
技术研发人员：周松林，姚淳，李萍，于彬，顾晓松，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32