人源化转基因动物制造技术

本发明专利技术涉及人源化改造的转基因非人动物，尤其是啮齿类动物，例如转基因小鼠。具体而言，本发明专利技术涉及包含人白介素17A(IL‑17A)基因、人基因17RA(IL‑17RA)和/或人TNF‑α基因的序列的转基因小鼠，其制备方法和用途。

Humanized transgenic animal

【技术实现步骤摘要】
人源化转基因动物本申请要求于2019年01月17日递交的申请号为CN201910044180.6，专利技术名称为“人源化转基因动物”的中国专利申请的优先权，以及2019年07月09日递交的申请号为CN201910616231.8，专利技术名称为“人源化转基因动物”的中国专利申请的优先权，在此全文引用上述中国专利申请公开的内容以作为本申请的一部分。
：本专利技术涉及基因工程领域，具体人源化改造的转基因非人动物，尤其是啮齿类动物，例如转基因小鼠。具体而言，本专利技术涉及包含人白介素17A(IL-17A)基因、人基因17RA(IL-17RA)和/或人TNF-α基因的序列的转基因小鼠，其制备方法和用途。技术背景：白细胞介素(interleukin,IL)17细胞因子(简称“IL-17”或“IL-17”)家族是一类特征性细胞因子，主要由活化的T细胞分泌。IL-17家族目前已经发现了6个成员，分别是IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(又称IL-25)和IL-17F。IL-17受体(简称“IL-17R”或“IL-17R”)也形成了一个独特的家族，目前发现了5个同源亚基，分别是IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE。IL-17通过与受体结合，启动其下游信号通路(包括MAP激酶途径、NF-kB途径、mRNA稳定信号途径、ERK信号途径以及JAK/STAT信号途径等)，刺激多种细胞产生炎症介质，已成为免疫和炎性疾病的关键参与因子，并可导致器官特异性或全身性自身免疫疾病。大量的研究已经证实多种自身免疫性疾病有着高水平的IL-17表达(如多发性硬化、哮喘、炎症性肠病、银屑病、和类风湿性关节炎等)。此外，IL-17还与多种自身免疫性疾病的发生发展密切相关，包括克罗恩病，白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、多发性硬化、心肌炎、I型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、银屑病等。此外，IL-17还在多种肿瘤组织中表达。IL-17具有与TNF-α、LTα、IFNγ和IL-1β等细胞因子协同扩大炎症的生物学效应。IL-17和IL-17R缺乏导致过敏原特异性免疫反应和自身免疫性炎症反应减少。通过特异性抗体阻断IL-17的体内生物学活性，在临床中已经表现出显著的效果。目前美国FDA已经批准三款靶向人IL-17/IL-17R相关抗体，包括IL-17A单抗Secukinumab、Ixekizumab和IL-17RA单抗Brodalumab，适应症主要是中重度斑块状银屑病。然而，这些药物存在明显的副作用，比如感染、腹泻等，以及Brodalumab与患者自杀倾向相关。更多靶向该信号通路的新型药物正在或已经进入临床研究。考虑到现有治疗自身免疫性疾病的药物大多只能改善疾病症状，远不能充分满足临床需求，仍需要开发更多靶向IL-17/IL-17R的药物。实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。由于人IL-17及其受体家族的氨基酸序列与啮齿类动物中的对应蛋白存在显著差异，如人IL-17A和小鼠IL-17A蛋白序列的一致性仅为60％，因此，识别人IL-17A蛋白的抗体通常无法识别小鼠IL-17A，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向IL-17/IL-17R信号通路药物的药效。鉴于IL-17/IL-17R在疾病发生过程中的广泛参与性和靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化IL-17/IL-17R信号通路相关的非人动物模型。
技术实现思路
除非特别说明，本专利技术的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：MolecularCloningALaboratoryManual,2ndEd.,ed.BySambrook，FritschandManiatis(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989)；DNACloning,VolumesIandII(D.N.Glovered.,1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.,1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4,683,195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss,Inc.,1987)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986)；B.Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；theseries,MethodsInENZYMOLOGY(J.AbelsonandM.Simon，eds.–in-chief,AcademicPress,Inc.,NewYork),Vols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.185,″GeneExpressionTechnology″(D.Goeddel,ed.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.,1987,ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker,eds.,AcademicPress,London,1987)；HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesV(D.M.WeirandC.C.Blackwell,eds.,1986)；和ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1986)。IL-17A/IR-17RA白细胞介素17细胞因子(简称“IL-17”或“IL-17”)家族是一类特征性细胞因子，主要由活化的T细胞分泌。IL-17家族目前已经发现了6个成员，分别是IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(又称IL-25)和IL-17F。IL-17家族的成员与任何其它已知的细胞因子序列相似性很差，而且家族成员之间的序列相似性也比较低：IL-17F与IL-17A具有最高的同源性(55％)，并且通常与IL-17A共表达；IL-17B，IL-17D和IL-17C的序列与IL-17A重叠29％至23％，而IL-17E似乎是该家族中最不同的成员，仅具有16％的序列同源性(GaffenSL,Nat.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。/n

【技术特征摘要】
20190117 CN 2019100441806;20190709 CN 2019106162311.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。


2.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞表达人IL-17A蛋白，任选所述蛋白包含与SEQIDNO:4具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:4或由SEQIDNO:4组成。


3.如权利要求1所述的细胞，其中所述人IL-17A基因的序列包含人IL-17A基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。


4.如权利要求1所述的细胞，其中所述人IL-17A基因的序列包含与SEQIDNO:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQIDNO:7或由SEQIDNO:7组成。


5.如权利要求1至3中任一项所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列，任选其中所述人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。


6.如权利要求5所述的细胞，其中所述细胞表达人IL-17RA蛋白或人源化IL-17RA蛋白，和/或人TNF-α蛋白，任选其中所述人IL-17RA包含与SEQIDNO:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:32或由SEQIDNO:32组成；
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQIDNO:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:32第49-341位所示的氨基酸序列；或
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQIDNO:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:39或由SEQIDNO:39组成；和
和/或所述人TNF-α蛋白包含与SEQIDNO:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:58或由SEQIDNO:58组成。


7.如权利要求5所述的细胞，其中所述人IL-17RA基因的序列包含人IL-17RA基因自2号外显子至11号外显子的序列。


8.如权利要求5所述的细胞，其中所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQIDNO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或所述人IL-17RA基因的序列包含SEQIDNO:35或由SEQIDNO:35组成。


9.如权利要求5所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。


10.如权利要求5所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQIDNO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQIDNO:61，或由SEQIDNO:61组成。


11.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列，任选其中所述人IL-17RA基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。


12.如权利要求11所述的细胞，其中所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQIDNO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQIDNO:35或由SEQIDNO:35组成。


13.如权利要求11或12所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人TNF-α基因的序列，其中所述人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。


14.如权利要求13所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。


15.如权利要求13所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQIDNO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQIDNO:61，或由SEQIDNO:61组成。


16.如权利要求1至15中任一项所述的细胞，其中所述转基因非人动物细胞是转基因啮齿类动物细胞或转基因小鼠细胞。


17.如权利要求1至16中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自体细胞和干细胞例如胚胎干细胞。


18.如或权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，郭朝设，郭雅南，白阳，黄蕤，赵磊，周小飞，张美玲，姚佳维，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11