具有自杀基因开关的靶向人间皮素的工程化免疫细胞制造技术

提供了一种靶向间皮素的嵌合抗原受体T细胞，该细胞的CAR结构中包含细胞自杀元件，并且细胞中的PD1基因表达是被沉默的。还提供了含有该细胞的制剂、用途以及用于制备细胞的试剂盒。

Engineered immune cells targeting human dermin with suicide gene switch

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有自杀基因开关的靶向人间皮素的工程化免疫细胞
本专利技术涉及免疫细胞治疗领域，更具体地涉及一种具有自杀基因开关的靶向人间皮素的工程化免疫细胞。
技术介绍
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起T细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以非MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。CAR-T细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。但是在实体肿瘤治疗中，Moon等发现在小鼠中注射meso-cart能够约束肿瘤的生长，但是不能治疗肿瘤。他们认为是肿瘤微环境中负调控因子的上调导致cart功能的减退，如在肿瘤微环境中，T细胞表面PD-1(programmed death protein-1)表达上调限制了T细胞的功能。有研究表明，在小鼠上用抗体阻断PD1后，CAR-T细胞功能得到增强。PD-1抗体可以提高CAR-T细胞功能，但是注射抗体后全身阻断PD1，增强了自体所有反应T细胞的激活，导致毒性较大。将CAR-T中PD-1的表达沉默只特异性解除肿瘤细胞对CART细胞的抑制作用，而不会对其他T细胞发挥作用，从而降低毒性，更好的发挥CART细胞抗肿瘤的效果。间皮素是一种肿瘤相关抗原，最早是Ira Pastan和Mark Willingham在卵巢癌中发现。他们发现间皮素高表达于卵巢癌细胞，但除了间皮细胞，在其他正常组织中不表达。目前研究发现，间皮素在间皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌及其他肿瘤组织中高表达，而在正常组织中有限表达。鉴于此，间皮素被列为一个免疫治疗的潜在靶点。目前，靶向间皮素的抗体及靶向间皮素的嵌合抗原受体T细胞(CART)等免疫治疗手段已有报道，但是发现用小鼠的抗人间皮素抗体所构建的CART在临床中出现抗鼠抗体及过敏反应等毒副作用以及相关肿瘤的治疗中疗效不理想等情况，因此需要进一步完善现有治疗技术，增强其疗效并控制好风险。综上所述，本领域仍然需要进一步的研究，开发一种能更有效、特异性好、副作用小地治疗血液肿瘤和实体瘤的CAR-T细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有自杀基因开关的靶向人间皮素的工程化免疫细胞。具体地，本专利技术的目的在于提供一种靶向间皮素(MSLN)的嵌合抗原受体T细胞，通过基因沉默的方法将其表面分子PD-1表达沉默，增加其肿瘤杀伤作用，同时加有自杀基因开关，以阻断未知的或不可控的远期毒性，保证患者的安全。在本专利技术的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞细胞具有以下特征：(a)所述细胞表达靶向间皮素的CAR或外源TCR，并且所述的CAR或TCR结构中包含细胞自杀元件，所述的细胞自杀元件包含选自下组的自杀基因开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、RQR8或其组合；和(b)所述细胞中的PD1基因表达是被沉默的。在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞选自下组：(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。在另一优选例中，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞具有以下特征：(a)所述细胞表达靶向间皮素的CAR，并且所述的CAR结构中包含细胞自杀元件，所述的细胞自杀元件包含选自下组的自杀基因开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、RQR8或其组合；和(b)所述细胞中的PD1基因表达是被沉默的。在另一优选例中，所述细胞中的TCR的表达是被沉默的。在另一优选例中，所述细胞中的TRAC基因表达是被沉默的，从而使得TCR的表达沉默。在本专利技术的另一方面，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞具有以下特征：(a)所述细胞表达靶向间皮素的CAR；和(b)所述细胞中的PD1基因表达是被沉默的；(c)所述细胞中的TCR的表达是被沉默的。在本专利技术的另一方面，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞具有以下特征：(a)所述细胞表达靶向间皮素的CAR；(b)所述细胞包含细胞自杀元件，所述的细胞自杀元件包含选自下组的自杀基因开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、RQR8或其组合；和(c)所述细胞中的PD1基因表达是被沉默的。在另一优选例中，所述的CAR的结构如下式I所示：L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-A-K    (I)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；L为任选的信号肽序列；scFv为靶向间皮素的抗体单链可变区序列；H为任选的铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；A为任选的蛋白标签；K为细胞自杀元件。在另一优选例中，所述的CAR的结构如下式I所示：K-L-scFv-H-TM-C-CD3ζ    (I)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；L为任选的信号肽序列；scFv为靶向间皮素的抗体单链可变区序列；H为任选的铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；K为细胞自杀元件。在另一优选例中，所述的蛋白标签与CD3ζ通过P2A连接。在另一优选例中，所述的A为选自下组的一种或多种蛋白标签：绿色荧光蛋白(GFP)、NGFRt、EGFRt、ΔCD19、ΔCD20、或其组合。在另一优选例中，所述的细胞自杀元件K与元件A通过P2A连接。在另一优选例中，所述的细胞自杀元件K与CD3ζ通过P2A连接。在另一优选例中，所述的细胞自杀元件的结构如下式II所示：B-D-F   (II)式中，各“-”独立地为连本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞细胞具有以下特征：/n(a)所述细胞表达靶向间皮素的CAR或外源TCR，并且所述的CAR或TCR结构中包含细胞自杀元件，所述的细胞自杀元件包含选自下组的自杀基因开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、或其组合；和/n(b)所述细胞中的PD1基因表达是被沉默的。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170930 CN 2017109166063一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞细胞具有以下特征：
(a)所述细胞表达靶向间皮素的CAR或外源TCR，并且所述的CAR或TCR结构中包含细胞自杀元件，所述的细胞自杀元件包含选自下组的自杀基因开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、或其组合；和
(b)所述细胞中的PD1基因表达是被沉默的。


如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞选自下组：
(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；
(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或
(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。


如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞为CAR-T细胞，并且所述CAR-T细胞具有以下特征：
(a)所述细胞表达靶向间皮素的CAR，并且所述的CAR结构中包含细胞自杀元件，所述的细胞自杀元件包含选自下组的自杀基因开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、RQR8或其组合；和
(b)所述细胞中的PD1基因表达是被沉默的。


如权利要求3所述的免疫细胞，其特征在于，所述细胞中的TCR的表达是被沉默的。


如权利要求4所述的免疫细胞，其特征在于，所述细胞中的TRAC基因表达是被沉默的，从而使得TCR的表达沉默。


如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述的CAR的结构如下式I所示：
L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-A-K (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为任选的信号肽序列；
scFv为靶向间皮素的抗体单链可变区序列；
H为任选的铰链区；
TM为跨膜结构域；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹卫，张华，张永亮，江鹏斐，刘丽萍，杨春辉，石欢，马玲，何佳平，马安云，沈连军，王欣欣，
申请(专利权)人：亘喜生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31