一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用。所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S1001菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年2月25日，保藏编号为CGMCC No.17255，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌种具有在兼性厌氧固态发酵条件下，利用生料高产四甲基吡嗪的特性，将其应用到生料固态培养工艺中，可以生产富含四甲基吡嗪的曲，对进一步提高酒体中健康活性物质具有重要作用。

Bacillus licheniformis with high yield of Tetramethylpyrazine and its isolation, culture and Application

【技术实现步骤摘要】
一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用
本专利技术属于微生物发酵
，涉及一种地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，尤其涉及一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用。
技术介绍
四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine)又名川芎嗪，是我国首先从常用中药川芎中提取出的生物碱，它是川芎治疗心脑血管疾病的有效成分之一，已被证明具有保肝、扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等作用，广泛应用于心脑血管疾病、肾小球疾病和呼吸系统疾病等的治疗。在中国白酒中亦检测到一定浓度的四甲基吡嗪，主要通过制曲和高温堆积发酵中经微生物和美拉德热反应共同作用产生，经蒸馏带入酒中，赋予了中国白酒以健康功能。CN101445786A公开了一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌XZ1124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M208157。该菌株来源自酱香型白酒的高温大曲，该菌株能以葡萄糖、蔗糖、糖蜜以及豆饼粉为底物，以大量积累内源前体来提高四甲基吡嗪的产量。解决了微生物发酵生产四甲基吡嗪中产物浓度低、需外源添加前体和前体利用率低的问题。CN107446860A公开了一种产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其应用，其中所述地衣芽孢杆菌的分类命名为地衣芽孢杆菌GJBL055，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月24日，保藏编号为CCTCCNO：M2017204。使用中温架子培养模式，将地衣芽孢杆菌接入到平板大曲中，通过对功能微生物的预培养、架子曲空间模型的构建，区房温度的四阶段调控，形成一种中温条件下高产四甲基吡嗪的大曲制造工艺，使大曲中四甲基吡嗪含量提高到提高到400mg/kg。CN101955980A公开了一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株，具体地说是一种微生物利用还原糖发酵积累前体乙偶姻、以及乙偶姻和氨经非酶促反应合成四甲基吡嗪的两步法生产工艺，属于生物工程
菌株利用还原糖发酵获得生物量并积累内源前体乙偶姻，然后，发酵体系中的乙偶姻和氨经非酶促催化反应合成四甲基吡嗪。乙偶姻积累量得以有效提高(38-44g/L)，高浓度的内源前体乙偶姻和氨在适宜的条件下可快速反应生成四甲基吡嗪(16-20g/L)，内源乙偶姻的积累以及原位发酵环境，显著提高了前体的利用率(40.3％)。且该方法是在液态条件下，通过添加外源铵盐来提高四甲基吡嗪的含量。但是，制曲和堆积过程为开放式发酵模式，微生物组成和结构比较复杂，很难进行过程参数控制来调控四甲基吡嗪的高效积累。同时，制曲过程周期长(30天)、效率低，且主要为酸性环境，不利于四甲基吡嗪的高效合成，致使四甲基吡嗪含量相对较低。同时，细菌麸曲纯种培养可以提高四甲基吡嗪含量，但该过程麸曲需要蒸煮，需消耗一定量的能耗。同时，大曲中产四甲基吡嗪的菌株主要为好氧菌，而白酒酿造为固态发酵模式，过程中大多为厌氧和兼性厌氧状态。因此，如何筛选一株能在兼性厌氧状态下且可在生料状态下高产四甲基吡嗪的菌株是非常有意义的，并将其用于白酒酿造过程，对增强酒体的功能性具有重要作用。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，尤其提供一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，具体包括一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌、其分离培养方法、其在制曲或食品酿造中的应用、一种高产四甲基吡嗪的细菌曲及其制备方法。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌，所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)S1001菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年2月25日，保藏编号为CGMCCNo.17255，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。上述“高产四甲基吡嗪”是指将该地衣芽孢杆菌以5％的接种量应用于细菌曲制作工艺中时，培养6天后，相对于每kg曲，四甲基吡嗪的含量可达到1590mg/kg。本专利技术筛选得到了一种具有在兼性厌氧固态发酵条件下，利用生料高产四甲基吡嗪特性的地衣芽孢杆菌，将该菌株应用到生料固态培养工艺中，生产富含四甲基吡嗪的曲，提高了生产效率，对进一步提高酒体中健康活性物质具有重要作用。同时，对功能性酿造微生物资源的强化利用和传统制曲过程的创新升级具有深远的社会和经济意义。第二方面，本专利技术提供一种如上所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的分离培养方法，所述分离培养方法包括如下步骤：(1)将高温大曲与无菌生理盐水混合后得到菌悬液；(2)将步骤(1)得到的菌悬液稀释并高温处理后于无菌固体培养基上进行培养，获得菌落；(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌固体培养基上进行分离纯化，获得单个纯种菌落并筛选出所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌。所述高温大曲为江苏今世缘酒业股份有限公司生产的高温大曲。优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基。优选地，所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括牛肉膏2-4g/L、蛋白胨8-12g/L、氯化钠4-6g/L、琼脂粉18-22g/L、溶剂为水；pH＝7.0-7.4。所述牛肉膏的浓度可以是2g/L、3g/L或4g/L等。所述蛋白胨的浓度可以是8g/L、9g/L、10g/L、11g/L或12g/L等。所述氯化钠的浓度可以是4g/L、5g/L或6g/L等。所述琼脂粉的浓度可以是18g/L、19g/L、20g/L、21g/L或22g/L等。所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH值可以为7.0、7.1、7.2、7.3或7.4等。优选地，步骤(2)所述高温处理是指在80-85℃(例如80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃等)下处理15-30min(例如15min、18min、20min、22min、25min、28min或30min等)。优选地，步骤(3)所述分离纯化的方法为：挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌固体培养基上进行5-10次划线培养，达到分离纯化的目的。优选地，步骤(3)所述筛选包括四甲基吡嗪产量能力测定和分子生物学鉴定。优选地，所述四甲基吡嗪产量能力测定的方法为：挑取单菌落进行液体培养，制备种子液，接种于麸皮固体培养基上35-40℃(例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等)培养18-30h(例如18h、20h、22h、25h、28h或30h等)，测定四甲基吡嗪含量。此操作是为了获得潜在的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌。所述分子生物学鉴定是指采用26SrDNA序列同源性分析法进行鉴定。优选地，所述麸皮固体培养基包括麸皮和水，每mL水中含有2-3g麸皮，例如2g、2.5g或3g等。优选地，所述筛选得到的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌保藏于无菌固体斜面培养基中备用。第三方面，本专利技术提供一种如上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S1001菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年2月25日，保藏编号为CGMCCNo.17255，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)S1001菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年2月25日，保藏编号为CGMCCNo.17255，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。


2.如权利要求1所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法包括如下步骤：
(1)将高温大曲与无菌生理盐水混合后得到菌悬液；
(2)将步骤(1)得到的菌悬液稀释并高温处理后于无菌固体培养基上进行培养，获得菌落；
(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌固体培养基上进行分离纯化，获得单个纯种菌落并筛选出所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌。


3.如权利要求2所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基；
优选地，所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括牛肉膏2-4g/L、蛋白胨8-12g/L、氯化钠4-6g/L、琼脂粉18-22g/L、溶剂为水；pH＝7.0-7.4；
优选地，步骤(2)所述高温处理是指在80-85℃下处理15-30min；
优选地，步骤(3)所述分离纯化的方法为：挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌固体培养基上进行5-10次划线培养，达到分离纯化的目的。


4.如权利要求2或3所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)所述筛选包括四甲基吡嗪产量能力测定和分子生物学鉴定；
优选地，所述四甲基吡嗪产量能力测定的方法为：挑取单菌落进行液体培养，制备种子液，接种于麸皮固体培养基上35-40℃培养18-30h，...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐群勇，吴建峰，季方，祝赛峰，胡烨烨，
申请(专利权)人：江苏今世缘酒业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32