一种用于根结线虫生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂的制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于根结线虫生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW‑6菌剂的制备及应用。所述甲基营养型芽孢杆菌LW‑6对抗逆性强，抗高温耐干旱生长繁殖快，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显等特点，且对人畜无毒及对环境友好。本发明专利技术甲基营养型芽孢杆菌LW‑6的活孢子和次生代谢产物具有防治烟草根结线虫以及烟草促生的功能，用滴灌处理防治根结线虫效率可达70.79%，且对根结线虫幼虫的杀虫率可达93%。所述的甲基营养型芽孢杆菌LW‑6经平板活化培养、种子培养和发酵制备得到的液体菌剂活孢子数可到50亿/ml，制备步骤包括优选平板培养、特定种子培养、优选发酵、超滤浓缩、低温干燥、剂型加工制备。

Preparation and application of a methyl nutritious Bacillus lw-6 for biological control of root knot nematode

【技术实现步骤摘要】
一种用于根结线虫生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂的制备及应用
本专利技术涉及一种用于根结线虫生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW-6的制备及应用，属于微生物
或者生物防治

技术介绍
烟草是重要的经济作物，其生长过程受到很多病害的危害，其中烟草根结线虫病为主要的土传病害，造成烟草的减产或绝收。根结线虫(Meloidogynespp.)是一类植物内寄生线虫，无严格的宿主特异性，能侵染多种农作物，严重危害农业生产，每年造成全球数千元亿美元的损失。根结线虫在全世界广泛分布，寄主范围广泛，它除直接危害外，还能传播细菌和真菌病害，造成许多经济作物的更大损失。在我国，随着烟草连载面积的扩大以及连作时间的延长，土壤传播的根结线虫病危害日趋严重，成为烟草生产的主要限制因素之一，导致烟叶减产和烟叶质量降低。根结线虫病的防治目前多采用化学防治、轮作及抗病品种，但效果均不太理想，且存在诸多弊端。如目前使用的化学杀线虫剂多为剧毒或高毒、高残留农药，对土壤微生物、植物、水源和大气层带来严重污染或破坏，同时病菌和线虫抗药性问题也日益突出，而且药物在植物体内残留会间接对人类造成危害。因此急需开发对环境友好，对人畜无毒的防治线虫病害的有益微生物菌剂。本专利技术利用现代生物工程、发酵工程技术，用优选的培养基、发酵液配方及工艺制备而成，本专利技术弥补上述技术空缺，以根结线虫生物防治和提高烟草作物的产量为目的一种甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂的制备及应用，本专利技术所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂是一种高效绿色的生防菌剂，具有防治烟草根结线虫以及烟草促生的功效。本专利技术甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂，是以所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6经优选平板培养、特定种子培养、优选发酵、超滤浓缩、低温干燥、剂型加工制备得到的LW-6菌剂，活孢子数可达50亿/ml，且本专利技术所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6对抗逆性强，生长繁殖快，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显等特点，对人畜无毒及对环境友好，而且和现代的滴灌技术相结合，具有使用简单的特点。因此，本专利技术在新的生物农药研发方面和应用方面都具有重要的理论和实践意义。
技术实现思路
第一目的在于提供所述的用于烟草根结线虫生物防治和促生的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂及其使用技术；第二目的在于提供所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂的制备方法。甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌株的获得：甲基营养型芽孢杆菌LW-6(Bacillusmethylotrophilus)，保藏单位为：CGMCC—中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCCNO.6793；保存时间：2012年11月07日，且检测结果为存活。本专利技术的第一目的和第二目的是这样实现的，所述甲基营养型芽孢杆菌LW-6对抗逆性强、生长繁殖快、抗高温耐干旱，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显。本专利技术的第二目的是这样实现的，是以所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6经优选平板培养、特定种子培养、优选发酵、超滤浓缩、低温干燥、剂型加工制备得到的LW-6菌剂，活孢子数可达50亿/ml，具体包括：(1)平板活化和优选培养：将甲基营养型芽孢杆菌LW-6原种斜面接种到平板培养基上活化，平板培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨3.5％，酵母浸膏1.3％，NaCl1.5％，琼脂粉5.7％，葡萄糖0.9％，碳酸钠0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸铁0.1％，余量为水，PH为7.2～7.3,培养条件为:在温度为32℃下培养80h。(2)种子培养：将活化的平板菌种接种到优选液体培养基中，在温度为32℃下培养80h，得发酵种子液；其中所述的液体培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨3.5％，酵母浸膏1.4％，NaCl1.8％，葡萄糖00.9％，碳酸钠0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸铁0.1％，余量为水，PH为7.2～7.3。余量为水，ph为7.2～7.3。(3)发酵：将发酵种子液按发酵培养基体积8％的量接种入发酵罐，在32℃下培养80h，搅拌速度为180rpm，通气量11％，在检测到活孢子数≥50亿活孢子/ml的时候，停止发酵，即得到甲基营养型芽孢杆菌LW-6发酵菌液；其中所述的发酵培养基的成分及其重量百分比为：豆饼粉2.4％，可溶性淀粉2.3％，酵母浸膏1.8％，葡萄糖0.9％,NaCNO30.05％、CaCO30.28％，碳酸钠0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸铁0.1％，余量为水，PH为7.2～7.3。(4)菌液浓缩、菌剂制备及剂型加工得到目标菌剂：将发酵液进行超滤浓缩，去掉42％水分；然后在浓缩发酵液中添加7％的轻钙载体充分混匀，然后进行低温干燥。将低温干燥菌粉加入表面活性剂、助剂后即达到本专利技术的目标菌剂。其中，发酵液进行超滤浓缩,去掉42％水分，其特征为：：使用孔径分别为0.004um、0.001um和1nm的3个超滤膜组件，将发酵液在37℃、压力0.3MPa条件下依次同时进行连续超滤处理，超滤时间3h,得到甲基营养型芽孢杆菌LW-6液体菌剂,活孢子数≥50亿/ml.在发酵浓缩液中,加入7％的轻钙载体充分混匀，然后进行低温干燥,干燥的临界温度的范围为39℃，最高加热温度为43℃。所述剂型加工，其特征为；按照体积比加入表面活性剂十二烷基苯磺酸钠3.2％、其他助剂为3.3％膨润土、1.8％的壳聚糖，1.2％的几丁质中的一种，余量为制备的目标菌粉。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂用于防治烟草根结线虫病以及烟草促生中的应用。本专利技术所述甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂和以所述甲基营养型芽孢杆菌LW-6为活性成分的制剂可应用于烟草根结线虫病的防治以及烟草促生，具有以下优点：1、本专利技术所述甲基营养型芽孢杆菌LW-6是一种高效生防细菌，以所述甲基营养型芽孢杆菌LW-6为活性成分的制剂对烟草根结线虫具有显著的毒杀作用，其粉剂制剂500倍稀释液对根结线虫的生物防治率为93％。2、本专利技术所述以甲基营养型芽孢杆菌LW-6为活性成分的制剂的制备方法简单易行，合理有效，有利于该菌剂的工业化生产和应用普及。本专利技术甲基营养型芽孢杆菌LW-6的活孢子和次生代谢产物对烟草根结线虫具有显著防效及对烟草的有明显的促生作用。本专利技术所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6以及甲基营养型芽孢杆菌LW-6为活性成分的制剂对人畜无毒，并且具有很强的环境适应性和环境友好性，且所述甲基营养型芽孢杆菌LW-6对抗逆性强，其芽孢具有抗高温耐干旱、生长繁殖快，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.6793。本专利技术所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂，是指所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂，甲基营养型芽孢杆菌LW-6来源于保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No .6793，所述甲基营养型芽孢杆菌LW-6对抗逆性强，其芽孢具有抗高温耐干旱、生长繁殖快，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显等特点，且对人畜无毒及对环境友好。/n

【技术特征摘要】
1.一种甲基营养型芽孢杆菌LW-6菌剂，甲基营养型芽孢杆菌LW-6来源于保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.6793，所述甲基营养型芽孢杆菌LW-6对抗逆性强，其芽孢具有抗高温耐干旱、生长繁殖快，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显等特点，且对人畜无毒及对环境友好。


2.一种权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6的菌剂，其特征在于是以所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6原种斜面经平板活化培养、种子培养、放大、超滤浓缩、低温干燥、剂型加工制备得到的LW-6菌剂。


3.一种权利要求2所述的甲基营养型芽孢杆菌LW-6的菌剂的制备方法，其特征在于包括平板活化培养、种子培养、发酵和液体菌剂制备步骤，具体包括：
（1）平板活化培养：将甲基营养型芽孢杆菌LW-6原种斜面接种到平板培养基上活化，在温度为32℃下培养80h，得活化的平板菌落；
（2）种子培养：将活化的平板菌种接种到液体培养基中，在温度为32℃下培养80h，得发酵种子液；
（3）发酵：将发酵种子液按发酵培养基体积8%的量接种入发酵罐，在32℃下培养80h，搅拌速度为180rpm，通气量11%，在检测到活孢子数≥50亿活孢子/ml的时候，停止发酵，即得到甲基营养型芽孢杆菌LW-6发酵菌液；
（4）将发酵液进行超滤浓缩，去掉42%水分；
（5）菌剂制备：在发酵液中添加7%的轻钙载体充分混匀，然后进行低温干燥；
(6)剂型加工；将上述低温干燥菌粉加入表面活性剂、助剂后即达到本发明的目标菌剂。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于（1）步骤中所述的平板培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨3.5%，酵母浸膏1.3%，NaCl1.5%，琼脂粉5.7%，葡萄糖0.9%，碳酸钠0.1%，硫酸镁0.1%，硫酸铁0.1%，余量为水，PH为7.2～7.3。


5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于（2）步骤中所述的液体培养基的成分及其重量百分比...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐少然，安航，唐满仓，安德荣，马玉明，
申请(专利权)人：陕西恒田生物农业有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61