一种分子探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提出了一种分子探针，其分子结构为

A molecular probe and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种分子探针及其制备方法与应用
本专利技术涉及药物化学和生物医学影像领域，特别是涉及一种分子探针及其制备方法与应用。
技术介绍
生物荧光成像技术是指利用荧光探针(分子)对细胞、组织甚至生物体进行成像，来研究生物学过程和信息的方法。荧光成像技术的关键是希望能获得直观清晰的图像来分辨细微结构，进而分析细胞或生物体特定区域的特征、状态，甚至特定分子的表达、分布等信息。生物荧光成像技术具有分辨率高、成像速度快和无损探测等优点，在探寻疾病的发病机理、临床表现、基因病变，疾病诊断和新的医疗手段的开发等方面具有重要的实践意义和应用前景。生物荧光成像技术在细胞和组织等体外检测方面已经发展到了极其成熟的阶段，商业化的可生物接枝的荧光染料基本上覆盖了整个可见光区以及近红外一区(400-850纳米)；相关配套的荧光显微镜及成像系统也接近完善。然而生物荧光成像在活体成像方面仍然面临巨大的瓶颈和挑战，主要原因有两个方面：其一是生物体本身存在可见光波段的自发荧光，导致活体成像的背景增大，分辨率大大降低；其二由于光子在穿透生物体存在着强烈的散射作用，因此无法进行比较深的活体荧光成像。解决此问题的方法就是选用发射波长较长的红外一区(750-900纳米)甚至近红外二区(1000-1700纳米)的荧光材料进行生物成像。IRDye800CW作为一种高效的近红外一区(750-900纳米)荧光探针，目前已经被广泛应用在实验活体成像甚至临床成像方面，取得了相比于可见光波段成像较好的活体成像效果。结直肠癌是全世界最常见的癌症之一，占所有恶性肿瘤的10％。结直肠癌的早期诊断、精准治疗以及及时的预后评估是影响癌症治疗效果及患者结局的重要因素。而传统的癌症治疗和靶向治疗的患者通常会出现耐药性。癌症免疫疗法很可能成为癌症临床治疗的关键。免疫检查点阻断已成为一种很有前途的癌症免疫治疗方法。针对PD-1/PD-L1的单克隆抗体的免疫疗法，通过结合配体或受体，阻断PD-1和PD-L1相互作用，在多种癌症中显示了显著的临床疗效，包括结直肠癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤。肿瘤中程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的表达已被用作预测抗PD-L1免疫治疗反应的生物标记。PD-L1的无创性检测可作为指导和监测免疫治疗的一个重要的生物学标志物。现有技术中有免疫组织化学技术、正电子发射断层显像(PET)技术和单光子计算机断层扫描的PD-L1检测、流式细胞仪、可溶性PD-L1的检测、液态活检等。但是，到目前为止，很少有用于直接快速检测结直肠癌PD-L1的近红外荧光分子探针。因此合成一个基于结直肠癌PD-L1表达水平的高选择性、高灵敏度的荧光分子探针具有重大的意义。本专利技术制备的光学分子探针NIR-PD-L1-mAb是利用800CWNHSEster与PD-L1mAb通过一步偶联反应制备而成的，可用于检测不同结直肠癌细胞(SW620、SW480和HCT8)中PD-L1的表达水平。
技术实现思路
荧光检测方法以其高灵敏度、操作简单，并且可应用于细胞成像等优点，受到了广泛的关注，近年来，也报道了一些利用800CW制备荧光分子探针的研究，但都未涉及结直肠癌荷瘤小鼠模型及PD-L1抗体相关应用，因此合成一个高选择性、高灵敏度并可应用于检测结直肠癌荷瘤小鼠PD-L1抗体表达的荧光分子探针仍然是一个具有挑战性的课题。为解决上述的问题，本专利技术提供了一种分子探针及其制备方法与应用，具体是通过以下技术方案来实现的：一种分子探针，该分子探针为NIR-PD-L1-mAb，所述的NIR-PD-L1-mAb化学结构式为一种分子探针的制备方法，具体包括以下步骤：a、纯化抗PD-L1单克隆抗体得到PD-L1mAb；b、将近红外光学染料加入DMSO溶液，配制成浓度为5mg/ml的溶液；c、取1～10mg/ml的PD-L1mAb放入离心管中，加入0.2mol/L～1.0mol/L的缓冲液混匀，PD-L1mAb与缓冲液的体积比为1:1，混匀后加入步骤b所得溶液，立即混匀，将混合液放入20～25℃水浴避光反应2小时；d、用PD-10柱纯化，合并蛋白峰管。进一步的，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。进一步的，所述缓冲液PH值为8.3～8.9。进一步的，所述近红外荧光染料为800CWNHSEster进一步的，所述PD-L1mAb与800CWNHSEster的摩尔比为1:1.1～1:3。进一步的，所述步骤a中纯化的具体步骤为：1)用Na2HPO4与MNaH2PO4配制50mmol/L的磷酸盐缓冲液，Na2HPO4与NaH2PO4的摩尔比为1:1，PH为8.5；2)用上述缓冲液将一根新的PD-10柱平衡；3)抗体浓度的测定：取Anti-PD-1抗体用紫外分光光度计测量OD280nm和OD260nm，计算抗体浓度；4)将步骤3的抗PD-1抗体全部上PD-1柱纯化，去除叠氮化钠，用磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰管；5)合并蛋白峰管后冷冻干燥。基于一种分子探针的应用，所述应用为一种分子探针在制备一种用于检测结直肠癌细胞中PD-L1的表达水平的显影剂中的应用。基于一种分子探针的应用，所述应用为一种分子探针在用于检测结直肠癌细胞中PD-L1的表达水平的试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果是：(1)在PD-L1检测时所采用的抗体单一；(2)检测结果评定直观；(3)无创，操作简单，定性、定量检测；实时检测肿瘤生物靶点，可重复。准确评估肿瘤生物靶点表达的动态变化情况；(4)同时显示原发灶和转移灶的表达，客观全面反应PD-L1的表达水平；(5)本专利技术提供的一种分子探针及其制备方法可用于快速准确检测不同结直肠癌细胞(SW620、SW480和HCT8)中PD-L1的表达水平。附图说明图1为本专利技术实施例中体外细胞和探针结合示意图；图2为本专利技术实施例中皮下瘤种植位置示意图；图3为本专利技术实施例中结直肠癌细胞SW620模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb分布脏器图；图4为本专利技术实施例中结直肠癌细胞SW620模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb分布荧光定量柱状图；图5为本专利技术实施例中结直肠癌细胞SW480模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb分布脏器图图6为本专利技术实施例中结直肠癌细胞SW480模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb荧光定量柱状图；图7为本专利技术实施例中结直肠癌细胞HCT8模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb分布脏器图；图8为为本专利技术实施例中结直肠癌细胞HCT8模型鼠体内NIR-PD-L1-mAb荧光定量柱状图。具体实施方法下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分子探针，其特征在于，该探针为NIR-PD-L1-mAb，所述的NIR-PD-L1-mAb化学结构式为/n

【技术特征摘要】
1.一种分子探针，其特征在于，该探针为NIR-PD-L1-mAb，所述的NIR-PD-L1-mAb化学结构式为





2.一种分子探针的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a、纯化抗PD-L1单克隆抗体得到PD-L1mAb；
b、将近红外光学染料加入DMSO溶液，配制成浓度为5mg/ml的溶液；
c、取1～10mg/ml的PD-L1mAb放入离心管中，加入0.2mol/L～1.0mol/L的缓冲液混匀，PD-L1mAb与缓冲液的体积比为1:1，混匀后加入步骤b所得溶液，立即混匀，将混合液放入20～25℃水浴避光反应2小时；
d、用PD-10柱纯化，合并蛋白峰管。


3.根据权利要求2所述的一种分子探针的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。


4.根据权利要求2所述的一种分子探针的制备方法，其特征在于，所述缓冲液PH值为8.3～8.9。


5.根据权利要求2所述的一种分子探针的制备方法，其特征在于，所述近红外荧光染料为800CWNHSEster。


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【专利技术属性】
技术研发人员：姜慧杰，姜昊，张茗昱，张琳焓，蔺雪，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23