本发明专利技术涉及利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，属于生物技术领域，所述试剂盒包括包被有M2抗原的化学发光板、酶标二抗、血清稀释液、20×PBST洗涤液、阳性对照血清、阴性对照血清、化学发光底物A液和B液。所述M2抗原是能区分型的多表位串联蛋白，所述多表位串联蛋白是将O型口蹄疫3个拓扑型中不同分离株的鉴别型表位串联所得；所述鉴别型表位为G‑H环的140‑154位氨基酸。本发明专利技术所述的试剂盒灵敏度高、特异性好、广谱性好、与免疫A型和Asia 1型单价苗血清无交叉反应，并且操作简单，反应时间短，在口蹄疫O型抗体检测中具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体地，涉及利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的以感染偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病。目前，我国对口蹄疫的预防和控制主要以免疫预防为主、扑杀为辅的综合性防控措施，同时结合免疫抗体的效价检测来评估免疫效果。FMDV有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1七种血清型。在我国流行的口蹄疫毒株有两种血清型的5个流行毒株，其中O型4个毒株，A型1个毒株，分别为O型Mya-98毒株、O型CATHAY毒株、O型PanAsia毒株、O型Ind-2001毒株和A型Sea-97毒株。流行的4个O型毒株归于3个拓扑性，分别为SEA、CATHAY、ME-SA拓扑性。目前国内免疫A、O二价苗居多，如果检测方法不能够很好的区分型，在免疫后如果只有一个毒株的抗原性(146S的完整性)良好，动物产生的抗体就会被不能区分型的诊断方法检测为口蹄疫抗体阳性，由于不同血清型之间无交叉免疫保护，而当遇到另一种毒株感染时，就会出现免疫不保护，因此能将不同血清型进行区分的诊断方法尤为重要。最近几年O型口蹄疫的流行呈上升趋势，简捷、有效的抗体检测方法，是免疫效果评价的指标，也是制定口蹄疫免疫程序的重要依据。世界动物卫生组织(OIE)推荐FMD免疫效果的评价方法有中和试验(VNT)、液相阻断ELISA(LPB-ELISA)和固相竞争ELISA(SPC-ELISA)。VNT是评价免疫效果最好的诊断方法，但需要使用活毒，因此不能被广泛使用。之后逐渐被LPB-ELISA替代，由于LPB-ELISA是使用灭活病毒和多抗建立的方法，因此与不同血清型免疫动物存在交叉反应，此外LPB-ELISA操作复杂、所用时间长(约4h)、成本高。最近几年各国学者利用型特异性单抗建立了针对各种血清型的检测方法，但该方法对单抗性能要求很高，筛选型特异性单抗是关键、也是难点，此外由于FMDV属于RNA病毒，易变异，新的毒株不断出现，这对型特异性的单抗也产生了挑战。传统的ELISA诊断方法耗时长，敏感性不高。化学发光免疫分析(CLIA)是一种在ELISA的基础上发展而来的新型检测技术。相比于ELISA，CLIA的所有能量来自于化学反应，因此消除了背景荧光信号，具有极高的敏感性，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足，本专利技术的目的在于提供利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，该试剂盒敏感性高，特异性好，与A型和AsiaI型单价苗免疫血清没有交叉反应，真正能够实现型间的区分；并且该试剂盒所用时间短，整个实验仅需25min。为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，包括包被M2抗原的化学发光板、酶标二抗、血清稀释液、20×PBST洗涤液、阳性对照血清、阴性对照血清、化学发光底物A液和B液；所述M2抗原是能区分型的多表位串联蛋白，所述多表位串联蛋白是将O型口蹄疫3个拓扑型中不同分离株的鉴别型表位串联所得；所述鉴别型表位为G-H环的140-154位氨基酸。进一步地，所述多表位串联蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)、鉴别型表位的筛选：通过比对GenBank上FMDV分离株的氨基酸序列，选择不同血清型之间有差异的位点，然后设计引物，并通过退火形成分别编码各表位蛋白的双链DNA分子，再将其分别与已经用相同酶酶切的线性化质粒进行连接，得连接产物；然后将连接产物进行转化表达；经IPTG诱导表达后，做WB进行验证；将验证可用的蛋白进一步纯化后进行ELISA验证；(2)、鉴别型表位的串联：最终确定G-H环的140-154位氨基酸为O型口蹄疫的优势抗原表位；然后将口蹄疫O型3个拓扑型共6个分离株的所述优势抗原表位进行串联，所述6个分离株分别为：O/MYA98/BY/2010,OS99,O/SCGH/CHA/2016,Akesu/58、O/CHA/7/2011、O/XJBC/CHA/2017；然后构建重组表达质粒；(3)、多表位串联蛋白的表达与纯化：将步骤二所得重组表达质粒进行转化，经IPTG诱导表达后，将菌液离心、超声破碎，取上清进行纯化，得多表位串联蛋白产物。进一步地：所述多表位串联蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。更进一步地，所述多表位串联蛋白的碱基序列为SEQIDNO：1所示。进一步地，所述化学发光板是用碳酸盐缓冲液将纯化的M2抗原蛋白稀释为500ng/ml，100μl/孔加入到化学发光板中，4℃过夜包被；PBST洗3-4次后，向每孔中加入200μl封闭液，于37℃封闭2h。甩掉拍干后，室温干燥2h，装袋真空封闭，4℃保存。更进一步地：所述的封闭液为含有体积分数为0.05％Tween-20、质量分数为5％蔗糖、质量分数为1％BSA和质量分数为0.1％proclin-300的PBS缓冲液。进一步地，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体；所述血清稀释液为含有质量分数为1％酪蛋白、体积分数为0.05％Tween-20、质量分数为0.1％proclin-300、质量分数为2％蔗糖和体积分数为2％大肠杆菌裂解液的磷酸盐缓冲液；所述20×PBST为pH7.2-7.4的浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，其中含有体积分数为1％的Tween-20；所述化学发光A液含有0.1mmol/L的鲁米诺和0.07mol/L的发光增强剂IPP，化学发光B液为3mmol/L的H2O2溶液。更进一步地，所述大肠杆菌裂解液的制备方法为：将pET-32a质粒转入大肠杆菌，37℃培养6h，离心收集菌体；然后将菌体溶解于PBS中，在冰浴条件下超声20min；然后离心，取上清，即为大肠杆菌裂解液。进一步地，所述阳性对照血清是将口蹄疫O/Mya98/BY/2010单价灭活疫苗免疫猪3次收集的血清；所述阴性对照血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清。有益效果：1、本专利技术检测猪口蹄疫O型病毒抗体的化学发光法所用的M2抗原为能区分型的表位串联蛋白，该表位串联蛋白包括了国内流行的O型口蹄疫3个拓扑型的表位。由于口蹄疫病毒是RNA病毒，变异速度快，而筛选型特异性的单抗难度大，并且往往会有个别突变株与特异性抗体亲和力低，导致漏检；或单抗特异性差，能与其他血清型的病毒反应，导致不能区分血清型。而使用表位串联蛋白可以大大降低难度，如果对新的突变株或境外传来的不同毒株的亲和力低，可以将该毒株的表位串联到原有的序列上，在很短的时间内实现更新换代。2、本专利技术所述M2抗原在制备过程中，通过将不同的线性表位连到pGEX-4T-1载体上，用WB和ELISA进行验证，从而筛选出能够区分型的鉴别型表位，确定能将O型与A型和Asia1型血清区分开的优势抗原表位，然后将口蹄疫O型3个拓扑型6个分离株的该表位进行串联，经由此得到的M2抗原作为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括包被M2抗原的化学发光板、酶标二抗、血清稀释液、20×PBST洗涤液、阳性对照血清、阴性对照血清、化学发光底物A液和B液；/n所述M2抗原是能区分型的多表位串联蛋白，所述多表位串联蛋白是将O型口蹄疫3个拓扑型中不同分离株的鉴别型表位串联所得；所述鉴别型表位为G-H环的140-154位氨基酸。/n
【技术特征摘要】
1.利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括包被M2抗原的化学发光板、酶标二抗、血清稀释液、20×PBST洗涤液、阳性对照血清、阴性对照血清、化学发光底物A液和B液；
所述M2抗原是能区分型的多表位串联蛋白，所述多表位串联蛋白是将O型口蹄疫3个拓扑型中不同分离株的鉴别型表位串联所得；所述鉴别型表位为G-H环的140-154位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述多表位串联蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）、鉴别型表位的筛选：通过比对GenBank上FMDV分离株的氨基酸序列，选择不同血清型之间有差异的位点，然后设计引物，并通过退火形成分别编码各表位蛋白的双链DNA分子，再将其分别与已经用相同酶酶切的线性化质粒进行连接，得连接产物；然后将连接产物进行转化表达；经IPTG诱导表达后，做WB进行验证；将验证可用的蛋白进一步纯化后进行ELISA验证；
（2）、鉴别型表位的串联：最终确定G-H环的140-154位氨基酸为O型口蹄疫的优势抗原表位；然后将口蹄疫O型3个拓扑型共6个分离株的所述优势抗原表位进行串联，所述6个分离株分别为：O/MYA98/BY/2010,OS99,O/SCGH/CHA/2016,Akesu/58、O/CHA/7/2011、O/XJBC/CHA/2017；然后构建重组表达质粒；
（3）、多表位串联蛋白的表达与纯化：将步骤二所得重组表达质粒进行转化，经IPTG诱导表达后，将菌液离心、超声破碎，取上清进行纯化，得多表位串联蛋白产物。
3.根据权利要求2所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述多表位串联蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。
4.根据权利要求3所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述多表位串联蛋白的碱基序列为SEQIDNO：1所示。
5...
【专利技术属性】
技术研发人员：常惠芸，刘伟，邵军军，常艳燕，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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