本发明专利技术了公开了一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，涉及核酸检测技术领域。本发明专利技术公开的试剂盒包括：引物探针预混液、阳性质控品、阴性质控品和反应预混液。该试剂盒针对人类免疫缺陷病毒设计了特定序列的引物和探针组合，其特异性高，覆盖度好；极大提高了芯片进孔效率，使用热启动Taq酶和UDG酶，有效降低了反应假阳性；能够有效检测DNA终浓度仅为1ng/μL的样本，有效分辨终浓度低至1copy/μL的标准品，灵敏度、准确性和稳定性更高，可以绝对定量，反应时间更快，成本更低。扩大了该试剂盒的使用范围，能够满足临床上超早期筛查的技术需求，还可以广泛应用于临床对于HIV活性的动态监测，以及对于抗病毒药物疗效的评估。
【技术实现步骤摘要】
一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒
本专利技术涉及核酸检测
，具体涉及一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒。
技术介绍
人类获得性免疫缺陷综合征(AcquiredImmunodeficiencySyndrome，AIDS)，又称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)引起的传染性疾病。1983年，HIV在美国首次被发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属于逆转录病毒的一种，根据其基因型差异分为HIV-1和HIV-2两个大型，各大型包括多种亚型。HIV通过破坏人体的T淋巴细胞，进而阻断细胞免疫和体液免疫过程，导致免疫系统瘫痪，从而致使各种疾病在人体内蔓延，最终导致艾滋病。目前，检测HIV的方法种类较多，主要包括HIV抗体及HIV核酸检测等。其中，HIV抗体检测包括筛查试验和确证试验，筛查试验包括ELISA法、化学发光法或免疫荧光试验等，确证试验常用的方法是免疫印迹法，这种方法简单、快速、成本较低，但灵敏度、精确度不高，且不能定量。特别是低浓度的样本，处于窗口期的新近感染者筛查试验也可呈阴性反应。HIV核酸检测常用方法有反转录PCR(RT-PCR)、分枝DNA信号放大系统(bDNA)和实时荧光定量PCR扩增(realtime-PCR)。核酸检测方法虽然灵敏度相对较高，对疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药性监测非常重要。病毒载量测定的临床意义包括预测疾病进程、提供开始抗病毒治疗依据、评估治疗效果、指导治疗方案调整以及HIV感染早期诊断的参考指标。但是该方法定量需要依靠不同浓度的标准品制备标准曲线，极大地提高了检测成本，检测结果是相对定量，无法做到绝对定量。同时，需要操作人员具备一定专业素质，对实验室环境要求也较高。除此之外，对于病毒载量极低的样本，检测会出现假阴性，灵敏度大大地降低。数字PCR(digitalPCR，dPCR)技术是近几年兴起的第三代PCR技术，一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几万至几百万个单元中进行反应，根据每个反应单元中扩增后的荧光信号相对比例和反应单元的体积，通过泊松分布计算出核酸靶分子的浓度。数字PCR技术无需采用内参基因和标准曲线，准确度高、重现性好，可以实现绝对定量分析，极大地提高了检测灵敏度和检出率。目前，比较成熟的数字化PCR平台，主要是伯乐公司的微滴式数字PCR和赛默飞公司的芯片式数字PCR。但是数字PCR仪器操作步骤多且复杂，微滴式数字PCR由于液滴有相对损耗，对于超低含量的目的物检测不准，需要额外的质控体系；芯片式数字PCR的也同样需要多种仪器组合，价格昂贵且操作不便利，无法满足临床便捷使用的需求。现有的检测HIV核酸的试剂盒大多是利用实时荧光定量PCR进行检测的。中国专利CN106498095A公开了一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，利用实时荧光定量PCR对各浓度梯度的样本进行检测，检测灵敏度为15IU/mL。该试剂盒及其检测方法的灵敏度较低，操作复杂，无法做到绝对定量，不适于检测极低浓度的样本。中国专利CN105018647B公开了一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16-18的试剂盒及其检测方法，基于数字PCR平台，对HPV进行绝对定量检测，可检测出1copy/μL的样本，对于浓度较低的样品，相对于荧光定量PCR，数字PCR方法的检测结果更为精确，且具有良好的分型检测效果。因此，本专利技术提供了一种基于芯片式数字PCR检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒。该试剂盒可以对血液、血清、精液、阴道分泌物、唾液等体液样本中HIV-cDNA进行检测，提供绝对定量。操作更加便捷，能够对极低检测目的物进行准确的定性、定量检测，灵敏度更高，数据结果稳定可靠，极大地降低了检测成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，克服了现有技术中存在的问题，能够对极低检测目的物进行准确的定性、定量检测，提高了灵敏度。本专利技术一方面提供了一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，所述的试剂盒包括引物探针预混液；所述的引物探针预混液包括HIV-cDNA的引物对、人GAPDH基因的引物对、HIV-cDNA的荧光探针和人GAPDH基因的荧光探针；所述HIV-cDNA的引物对为：上游引物：5’-TTGACTAGCGGAGGCTAGA-3’，如SEQIDNO:1所示；下游引物：5’-CCCTGGCCTTAACCGAAT-3’，如SEQIDNO:2所示；所述人GAPDH基因的引物对为：上游引物：5’-CTAGCTGGCCCGATTTCTCC-3’，如SEQIDNO:3所示；下游引物：5’-CGCCCAATACGACCAAATCAGA-3’，如SEQIDNO:4所示；所述HIV-cDNA的荧光探针的核苷酸序列为：5’-CTGACGCTC+TCGCACCCATCTCTC-3’，如SEQIDNO:5所示；所述人GAPDH基因的荧光探针的核苷酸序列为：5’-TCCGGGTGA+TGCTTTTCCTAGA-3’，如SEQIDNO:6所示；其中“+”表示3’端的碱基为锁核酸修饰碱基。所述的锁核酸的结构式如式(1)所示：优选地，所述HIV-cDNA和/或人GAPDH基因的荧光探针的5’端含有荧光报告基团FAM和/或CY3，3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1和/或BHQ-2。进一步优选地，所述的HIV-cDNA的荧光探针的5’端含有荧光报告基团FAM，3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1；所述的人GAPDH基因的荧光探针的5’端含有荧光报告基团CY3，3’端含有荧光淬灭基团BHQ-2。优选地，所述的引物探针预混液中用于检测HIV-cDNA的引物对、人GAPDH基因的引物对、HIV-cDNA的荧光探针和人GAPDH基因的荧光探针的浓度比为2:2:1:1。优选地，所述的试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品；所述的阳性质控品是由包含20000copies/μL的HIV-cDNA片段的质粒与等体积的10ng/μL的人正常T淋巴细胞系DNA混合而成；所述的阴性质控品是10ng/μL的人正常T淋巴细胞系DNA。具体地，所述的人正常T淋巴细胞系为H9细胞系。优选地，所述的试剂盒还包括反应预混液，所述的反应预混液包括但不限于：dATP、dCTP、dGTP、dUTP、BSA(牛血清白蛋白)、热启动Taq酶、尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG酶)、ROX、TritonX-100和热稳定焦磷酸酶；进一步优选地，所述的热启动Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基酶的浓度比为0.5-1.5:1。更优选地，热启动Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基酶的浓度比为1:1。进一步优选地，所述的反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP浓度均为0.4mM，BSA浓度为10μg/μL，ROX浓度为100nM，TritonX-100浓度百分比为0.2％，热稳定焦磷酸酶为0.2U。本专利技术另一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括引物探针预混液；/n所述的引物探针预混液包括HIV-cDNA的引物对、人GAPDH基因的引物对、HIV-cDNA的荧光探针和人GAPDH基因的荧光探针；/n所述HIV-cDNA的引物对为：/n上游引物：5’-TTGACTAGCGGAGGCTAGA-3’；/n下游引物：5’-CCCTGGCCTTAACCGAAT-3’；/n所述人GAPDH基因的引物对为：/n上游引物：5’-CTAGCTGGCCCGATTTCTCC-3’；/n下游引物：5’-CGCCCAATACGACCAAATCAGA-3’；/n所述HIV-cDNA的荧光探针的核苷酸序列为：/n5’-CTGACGCTC+TCGCACCCATCTCTC-3’；/n所述人GAPDH基因的荧光探针的核苷酸序列为：/n5’-TCCGGGTGA+TGCTTTTCCTAGA-3’；/n其中“+”表示3’端的碱基为锁核酸修饰碱基。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括引物探针预混液；
所述的引物探针预混液包括HIV-cDNA的引物对、人GAPDH基因的引物对、HIV-cDNA的荧光探针和人GAPDH基因的荧光探针；
所述HIV-cDNA的引物对为：
上游引物：5’-TTGACTAGCGGAGGCTAGA-3’；
下游引物：5’-CCCTGGCCTTAACCGAAT-3’；
所述人GAPDH基因的引物对为：
上游引物：5’-CTAGCTGGCCCGATTTCTCC-3’；
下游引物：5’-CGCCCAATACGACCAAATCAGA-3’；
所述HIV-cDNA的荧光探针的核苷酸序列为：
5’-CTGACGCTC+TCGCACCCATCTCTC-3’；
所述人GAPDH基因的荧光探针的核苷酸序列为：
5’-TCCGGGTGA+TGCTTTTCCTAGA-3’；
其中“+”表示3’端的碱基为锁核酸修饰碱基。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HIV-cDNA和/或人GAPDH基因的荧光探针的5’端含有荧光报告基团FAM和/或CY3，3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1和/或BHQ-2。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的HIV-cDNA的荧光探针的5’端含有荧光报告基团FAM，3’端含有荧光淬灭基团BHQ-1；
所述的人GAPDH基因的荧光探针的5’端含有荧光报告基团CY3，3’端含有荧光淬灭基团BHQ-2。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物探针预混液中用于检测HIV-cDNA的引物对、人GAPDH基因的引物对、HIV-cDNA的荧光探针和人GAPDH基因的荧光探针的浓度比为2:2:1:1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品；
所述的阳性质控...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘一博，金鑫浩，任鲁风，张未来，于军，
申请(专利权)人：宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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