一种硅珠法核酸提取试剂盒及其使用方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种硅珠法核酸提取试剂盒及其制备方法和应用。所述硅珠法核酸提取试剂盒包括裂解液A、裂解液B、蛋白酶K溶液、吸附液、吸附珠悬液、漂洗液和洗脱液；其中，所述裂解液A、裂解液B和蛋白酶K溶液混合形成裂解液。所述裂解液A、裂解液B和蛋白酶K溶液按比例配制之后，一方面可加大裂解液的使用体积，有利于完全浸没检材，以使细胞中的核酸能够充分释放；同时，能够解决裂解液A和B之间的相互作用导致的裂解效率低以及见光分解等问题，使裂解液充分有效地裂解细胞，裂解效率高，得到浓度更高的核酸，有利于提高核酸的质量，保证后续操作的准确性。

A silicon bead nucleic acid extraction kit and its application

【技术实现步骤摘要】
一种硅珠法核酸提取试剂盒及其使用方法和应用
本专利技术涉及核酸检测技术，具体涉及一种，尤其涉及一种硅珠法核酸提取试剂盒及其使用方法和应用。
技术介绍
随着DNA检验技术的进步，DNA提取已经成为影响DNA检验成功与否的关键环节。而如何从痕量检材中提取足够数量的优质DNA，一直是法医DNA检验领域的重大难题。目前DNA提取的主要方法包括基于吸附解离原理的磁珠法、硅珠法和基于分子量差异的柱法、滤膜法。硅珠法与磁珠法的原理相近，提取核酸的流程大体相同，基本上分为四个基本步骤：(1)利用硫氰酸胍等强烈蛋白变性剂，破坏检材的细胞膜及核膜蛋白，释放DNA，并使核酸酶失活；(2)加入磁珠或硅珠进行特异性吸附；(3)通过洗涤液酸碱度、离子强度的控制进行漂洗纯化，去除PCR抑制剂；(4)更换溶液环境，在溶解液中进行DNA与磁珠或者硅珠的解离，将DNA重新溶出，从而达到提取纯化的目的。硅珠法在脱落细胞等微量生物检材以及骨骼、牙齿等疑难生物检材中的成功应用得到了很多学者的认可。然而目前，市场现有硅珠法核酸提取试剂盒较少，且质量参差不齐，因此总体而言磁珠法市场占比大于硅珠法。虽然市场占比较小，但硅珠法在核酸提取方面具备特殊的优势：1、抗抑制能力强，可适用于高度腐败污秽等复杂法医检材；2、可带珠扩增，有效提高提取灵敏度。CN105462961A公开了一种提取核酸的方法及试剂盒。本专利技术所述方法向待提取样品中加入裂解液裂解释放核酸分子，然后加入吸附核酸的材料以及结合液对核酸分子进行吸附，获得核酸-吸附材料复合物；将核酸-吸附材料复合物洗涤后，用含有表面活性剂的水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱下来的溶液，获得目标核酸分子。本专利技术针对现有提取核酸的方法的缺陷，在洗脱环节中将表面活性剂加入到洗脱液中，进而提高了洗脱核酸的得率，获得更多量的核酸分子，同时提取后的核酸长久保存而不被吸附在管壁或者被核酸酶降解，眼馋了核酸分子的保存时间。CN109694863A公开了一种用于核酸提取的裂解液、清洗液、核酸提取试剂盒及核酸的提取方法。该核酸提取试剂盒包括裂解液，裂解液包括20-200mmol/L的NaCl、10-50mmol/L的Tris、10-50mmol/L的EDTA、质量百分含量为0.1-0.5％的十二烷基硫酸钠、质量百分含量为2-5％的TritonX-100、0.5-1mol/L的NaBrO3及0.5-1mol/L的异硫氰酸胍。上述核酸提取试剂盒能够提取得到较高浓度的核酸。因此，提供一种裂解效率高、提取效率高的硅珠法核酸提取试剂盒，能够有效提取法医检材内的DNA，为DNA检验提供基础。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种硅珠法核酸提取试剂盒及其使用方法和应用。所述硅珠法核酸提取试剂盒提取得到的DNA纯度较高，检测精度较好，且制备方法简单，易于保存。为达此目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种硅珠法核酸提取试剂盒，所述硅珠法核酸提取试剂盒包括：裂解液A、裂解液B、蛋白酶K溶液、吸附液、吸附珠悬液、漂洗液和洗脱液；其中，所述裂解液A、裂解液B和蛋白酶K溶液混合形成裂解液。本专利技术中，本专利技术中提供的裂解液包括裂解液A、裂解液B和蛋白酶K溶液，所述溶液按比例配制之后，可加大裂解液的使用体积，有利于完全浸没检材，使裂解液充分有效地裂解细胞，裂解效率高，以使细胞中的核酸能够充分释放，得到浓度更高的核酸，有利于提高核酸的质量，保证后续操作的准确性。同时，将裂解液A和裂解液B分别配制，能够解决裂解液A和B之间的相互作用导致的裂解效率低的问题，也减少了裂解液B在存储过程中产生的见光分解问题，而且本专利技术提供的试剂盒易于存储。所述裂解液A包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠或乙二胺四乙酸二钠二水合物中的任意一种或两种以上的组合。其中，三羟甲基氨基甲烷为常用核酸溶剂，可稳定溶液pH；氯化钠提供必要的离子环境，为后续核酸DNA与硅珠结合提供钠离子；乙二胺四乙酸二钠作为金属螯合剂，可螯合溶液中可能存在的重金属镁离子、铁离子等，保护DNA完整性。优选地，所述裂解液A包括摩尔浓度为0.005-0.015M的三羟甲基氨基甲烷、0.05-0.15M的氯化钠和0.005-0.015M的乙二胺四乙酸二钠二水合物。所述裂解液A中三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为0.005-0.015M，例如可以是0.005M、0.006M、0.008M、0.01M、0.012M、0.014M或0.015M等。所述裂解液A中氯化钠的摩尔浓度为0.05-0.15M，例如可以是0.05M、0.06M、0.08M、0.1M、0.12M、0.14M或0.015M等。所述裂解液A中乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTANa2·2H2O)的摩尔浓度为0.005-0.015M，例如可以是0.005M、0.006M、0.008M、0.01M、0.012M、0.014M或0.015M等。作为本专利技术优选的技术方案，所述裂解液B包括离子型表面活性剂。离子型表面活性剂可破坏细胞膜结构，使蛋白变性，将核酸DNA释放至溶液中。优选地，所述离子型表面活性剂为阴离子表面活性剂。优选地，所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠(SDS)。优选地，所述裂解液B中十二烷基磺酸钠的质量浓度为8-12％，例如可以是8％、8.2％、8.4％、8.5％、8.8％、9％、9.5％、10％、10.4％、10.5％、10.8％、11％、11.2％、11.5％、11.8％或12％等。优选地，所述蛋白酶K溶液中蛋白酶K的浓度为8-12mg/mL，例如可以是8mg/mL、8.5mg/mL、9mg/mL、9.5mg/mL、10mg/mL、10.5mg/mL、11mg/mL、11.5mg/mL或12mg/mL等。所述蛋白酶K为一类具有强力消化蛋白质的生物制剂，可消化与DNA相结合的蛋白，使DNA释放并溶解于溶液中。作为本专利技术优选的技术方案，所述裂解液A、裂解液B与蛋白酶K溶液以体积比为(4-6):1:(0.4-0.6)的比例混合形成裂解液，例如可以是4:1:0.4、4.2:1:0.4、4.4:1:0.4、4.6:1:0.4、4.8:1:0.4、5:1:0.4、5.2:1:0.4、5.4:1:0.4、5.6:1:0.4、5.8:1:0.4、6:1:0.4、4:1:0.42、4:1:0.44、4:1:0.46、4:1:0.48、4:1:0.5、4:1:0.52、4:1:0.55、4:1:0.56、4:1:0.58、4:1:0.6、4.5:1:0.6、5:1:0.5、6:1:0.5或6:1:0.6等。作为本专利技术优选的技术方案，所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷和/或乙二胺四乙酸二钠二水合物。所述洗脱液用于将DNA重新从硅珠上释放至洗脱液中。优选地，所述洗脱液包括摩尔浓度为8-12mM三羟甲基氨基甲烷和0.08-0.12mM乙二胺四乙酸二钠二水合物。本专利技术中所述洗脱液中，乙二胺四乙酸二钠二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硅珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述硅珠法核酸提取试剂盒包括：/n裂解液A、裂解液B、蛋白酶K溶液、吸附液、吸附珠悬液、漂洗液和洗脱液；/n其中，所述裂解液A、裂解液B和蛋白酶K溶液混合形成裂解液。/n

【技术特征摘要】
1.一种硅珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述硅珠法核酸提取试剂盒包括：
裂解液A、裂解液B、蛋白酶K溶液、吸附液、吸附珠悬液、漂洗液和洗脱液；
其中，所述裂解液A、裂解液B和蛋白酶K溶液混合形成裂解液。


2.根据权利要求1所述的硅珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液A包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠或乙二胺四乙酸二钠二水合物中的任意一种或两种以上的组合；
优选地，所述裂解液A包括摩尔浓度为0.005-0.015M的三羟甲基氨基甲烷、0.05-0.15M的氯化钠和0.005-0.015M的乙二胺四乙酸二钠二水合物。


3.根据权利要求1或2所述的硅珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液B包括离子型表面活性剂；
优选地，所述离子型表面活性剂为阴离子表面活性剂；
优选地，所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠；
优选地，所述裂解液B中十二烷基磺酸钠的质量浓度为8-12％；
优选地，所述蛋白酶K溶液中蛋白酶K的浓度为8-12mg/mL；
优选地，所述裂解液A、裂解液B与蛋白酶K溶液的以体积比为(4-6):1:(0.4-0.6)混合配制形成裂解液。


4.根据权利要求1-3任一项所述的硅珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷和/或乙二胺四乙酸二钠二水合物；
优选地，所述洗脱液包括摩尔浓度为8-12mM三羟甲基氨基甲烷和0.08-0.12mM乙二胺四乙酸二钠二水合物。


5.根据权利要求1-4任一项所述的硅珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，所述吸附珠为硅羟基修饰的纳米二氧化硅颗粒；
优选地，所述纳米二氧化硅颗粒的粒径为150-250nm；
优选地，所述吸附液包括异硫氰酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠二水合物或聚乙二醇辛基苯基醚中的任意一种或两种以上的组合；
优选地，所述吸附液包括摩尔浓度为3-5M的异硫氰酸胍、0.04-0.06M的三羟甲基氨基甲烷、0.01-0.03M的乙二胺四乙酸二钠二水合物和质量分数为2-3wt％的聚乙二醇辛基苯基醚；
优选地，所述漂洗液为质量分数为70wt％的乙醇水溶液。


6.一种如权利要求1-5任一项所述的硅珠法核酸提取试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：
(1)将裂解液A、裂解液B和蛋白酶K溶液混合后得到裂解液，将所述裂解液与待测检材混合，裂解；...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗深恒，陈光，陈嘉棋，
申请(专利权)人：广州高盛生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44