本发明专利技术公开了钙蛋白酶抑制剂在制备治疗内毒素导致的急性肾损伤的药物中的应用，该应用中，钙蛋白酶抑制剂通过抑制内皮细胞calpain保护内毒素导致的急性肾损伤。本发明专利技术使用calpain的抑制剂钙蛋白酶抑制剂，并结合使用多种细胞特异性calpain敲除鼠，一者来研究内皮细胞calpain在急性肾损伤中的作用及可能的作用机制，二者研究钙蛋白酶抑制剂III做为治疗措施备选物的可能性，应用钙蛋白酶抑制剂抑制calpain活性后，可抑制p38磷酸化，进而降低iNOS表达及NO和ROS的产生，抑制内皮细胞凋亡，从而在LPS导致的肾损伤中发挥保护作用。
Application of calpain inhibitor in the preparation of drugs for the treatment of acute renal injury caused by endotoxin
【技术实现步骤摘要】
钙蛋白酶抑制剂在制备治疗内毒素导致的急性肾损伤的药物中的应用
本专利技术涉及钙蛋白酶抑制剂在制备治疗内毒素导致的急性肾损伤的药物中的应用。
技术介绍
急性肾损伤是重症监护室患者常见的并发症之一，其中，脓毒症是导致急性肾损伤的重要原因。脓毒症状态下，许多因素可导致急性肾损伤，包括：血流动力学不稳定、微循环障碍、内皮损伤等。正常情况下，肾脏可接受20％的心输出量，肾脏中丰富的毛细血管在维持肾小球滤过率的过程中发挥重要作用。血管内皮细胞在维持机体稳态、血-肾屏障中扮演重要角色。在脓毒症中，血管内皮细胞暴露至许多刺激下，包括内毒素、炎症因子等。血管内皮发生结构性的改变，如内皮细胞凋亡、细胞-细胞间粘附改变等，导致内皮通透性增加、屏障功能下降，进而导致白蛋白等大分子渗漏进入尿液中，同时伴随白细胞从血管游出增加，进入肾间质中，导致实质性肾损伤。因此，内皮细胞在脓毒症导致的急性肾损伤中扮演重要角色，而目前针对脓毒症中内皮细胞损伤的机制尚不完全明确，给针对性制定干预措施造成了困难。
技术实现思路
Calpain是钙依赖性的半胱氨酸家族的蛋白酶，广泛存在于全身各组织中，广泛参与多种病理和生理过程。我们前期研究发现，calpain活化与活性氧、过氧硝酸盐的产生增加相关，而内皮细胞对于这些血管活性物质十分敏感，可能影响了急性肾损的的病理发展过程，而目前对于这一内容尚无报道，明确内皮细胞在脓毒症急性肾损伤中的病理机制，可为临床治疗提供方向。而针对性应用calpain的抑制剂钙蛋白酶抑制剂III来干预，从而发挥保护内毒素所致的肾损伤则可能为治疗提供了一个切实可用的备选物。本专利技术使用calpain的抑制剂钙蛋白酶抑制剂III，并结合使用多种细胞特异性calpain敲除鼠，一者来研究内皮细胞calpain在急性肾损伤中的作用及可能的作用机制，二者研究钙蛋白酶抑制剂III做为治疗措施备选物的可能性。本专利技术应用钙蛋白酶抑制剂III抑制calpain活性后，可抑制p38磷酸化，进而降低iNOS表达及NO和ROS的产生，抑制内皮细胞凋亡，从而在LPS导致的肾损伤中发挥保护作用。附图说明图1：内皮细胞Capn4特异性敲除在LPS肾损伤中的作用展示图。图2：LPS(I.P，4mg/kg)刺激18小时后calpastatin过度表达(Tg-CAST)和淋巴细胞Capn4特异性敲除(LYZ/Capn4-/-)小鼠肾脏损伤的变化展示图。图3：钙蛋白酶在LPS诱导PMECs凋亡中的作用展示图。图4：MAPK家族成员在PMECs诱导LPS凋亡中的作用展示图。图5：LPS(I.P，4mg/kg)刺激内皮细胞Capn4特异性敲除(KO)小鼠18小时后肾脏NO和ROS浓度的变化展示图。图6：LPS(I.P，4mg/kg)刺激内皮细胞Capn4特异性敲除(KO)小鼠18h后肾脏iNOS、eNOSmRNA及蛋白水平的变化展示图。图7：不同剂量LPS(0.1-10ug/ml)刺激PMECs18h后iNOS表达和NO生成的变化展示图。图8：钙蛋白酶对脂多糖刺激的PMECsp38激活、诱导iNOS表达和NO生成的作用展示图。图9：钙蛋白酶和p38激活对脂多糖刺激的PMECs一氧化氮生成的作用展示图。图10为内毒素血症小鼠肾功能损害的信号转导途径示意图。具体实施方式材料和方法从杰克逊实验室购买了一对C57BL/6小鼠，法国巴黎国家圣母院劳伦特·鲍德博士(DrLaurentBaud)提供了calpastatin(Tg-CAST)过度表达的转基因小鼠。从Jackson实验室购买了内皮细胞特异性Capn4基因敲除(TEK/Capn4-/-)和淋巴细胞特异性Capn4基因敲除(LYZ/Capn4-/-)的转基因小鼠，并在我们的动物护理机构实施了一项育种计划。所有的动物都被按时提供食物和水，并被安置在一个温度和湿度控制的设施中，有12小时的光和暗循环。Western大学的动物使用小组委员会批准了所有实验方案，并按照加拿大动物护理委员会的指导方针使用了所有的动物。内毒素血症动物模型的建立根据我们先前的研究，内毒素血症动物模型是以LPS(4mg/kg，I，p，Sigma)或生理盐水为对照制备的。18小时后，用心脏穿刺对动物实施安乐死和失血。根据Madorin等人公布的方法对血液进行处理以获得血浆。此外，收集尿液和肾组织作进一步检查。小鼠肺微血管内皮细胞-PMECs培养及处理从成年C67BL/6小鼠中分离PMECs，并按上述方法培养，所有PMECs在5代内用于本研究，Calpain抑制剂III、SB203580、PD98059和SP600125购自Sigma、Calbiochem或LifeTechnology。所有抑制剂均在其他治疗前使用1小时。用指示浓度的LPS处理细胞18小时，或用上述抑制剂预处理1小时，然后用LPS刺激(1ug/ml)再处理18小时。肾功能测定血尿素氮(BUN)根据试剂盒制造商的说明进行测定(生物测定系统，加利福尼亚州海沃德)。在动物被安乐死前收集小鼠尿液。根据制造商的说明(德克萨斯州蒙哥马利市Bethyl实验室)测量尿白蛋白。caspase-3活性使用caspase-3荧光检测试剂盒，根据制造商的协议(生物醇研究实验室)测量组织和细胞caspase-3活性。DNA片段在其他处理之前，用BrdU预标记细胞24小时。根据制造商的说明，使用细胞DNA片段ELISA试剂盒(罗氏应用科学)测量DNA片段。凋亡细胞的原位检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法。肾组织用10％福尔马林固定，石蜡包埋。固定的肾组织被切成3毫米厚的块。组织块用石蜡包埋，切成5毫米的薄片。脱蜡(使用二甲苯和乙醇稀释液)和再水化后，用凋亡标记过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒(Chemicon，CA，USA)对切片进行TUNEL染色，如先前的研究所述。在200倍镜下，从10个视野中随机选取TUNEL阳性细胞计数，定量分析凋亡细胞死亡。结果显示每200倍视野中TUNEL阳性细胞数。钙蛋白酶活性如我们之前的研究所述，使用荧光底物N-琥珀酰-LLVY-AMC(加拿大安大略省伯林顿市Cedarlane实验室)测定钙蛋白酶活性。PMECs的腺病毒感染以含有大鼠calpastatin基因的腺病毒载体(美国布法罗大学AdCAST)或HA(Ad-HA，载体生物实验室)感染培养的PMECs作为对照，检测了10个PFU/细胞的多重感染。腺病毒介导的基因转移如前所述。所有实验均在腺病毒感染24小时后进行。Westernblot从肾组织或体外培养的PMECs中提取蛋白，用SDS-PAGE法检测蛋白含量。用过氧化物酶结合的二级抗体(羊抗兔IgG-HRP，Bio-Rad实验室)和增强化学发光法(Amersham)检测一级抗体的结合，并用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.钙蛋白酶抑制剂在制备治疗内毒素导致的急性肾损伤的药物中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.钙蛋白酶抑制剂在制备治疗内毒素导致的急性肾损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述钙蛋白酶抑制剂为钙蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘志锋，吉晶晶，苏磊，
申请(专利权)人：中国人民解放军南部战区总医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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