一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法技术

本发明专利技术涉及一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法，包括使用自主设计的引物进行扩增，加入扩增增强剂，选用特定的扩增条件等等。本发明专利技术降低了FMR1扩增的难度，可同时检测基因型，三代测序检测全长，CGG重复的检出更精确。

Primer, system and method of FMR1 detection based on three generations sequencing

【技术实现步骤摘要】
一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法。
技术介绍
脆性X综合征(FXS)发生的分子机制为FMR1基因DNA层面CGG重复。该重复会引起FMR1表达缺乏，该基因编码RNA结合蛋白脆性X蛋白(FMRP)，是负责智力迟滞的相关蛋白。该蛋白的缺乏会导致最常见的遗传性智力低下疾病-脆性X综合征。按正常人群中女性FMR1前突变携带率为1/130-1/256推算，中国目前有五百万至一千万女性潜在携带者。携带者有50％的几率将FMR1突变基因遗传给子女，子女存在着FMR1全突变而罹患脆性X综合征的风险。其风险率与母亲FMR1前突变CGG重复次数有关。重复次数越多其风险越高，按CGG的重复次数对个体进行分类，正常(5-54CGG重复)、前突变(55-200重复)或完全突变(>200重复)，患病风险将从40％逐渐增加到100％。其中FMR1完全突变的男孩100％患病，女孩30％-40％患病。现在患者中发现的最多重复CGG序列>230异常甲基化，导致FMR1基因转录沉默。其发病率仅次于先天愚型(21三体-唐氏综合征)。患儿表现为重度智力残疾，同时还伴有行为发育异常或容易患孤独症。值得关注的是自发现脆性X综合征近50年来，现代医学一直无法进行有效而准确的产前筛查，导致大量的脆性X综合征患儿降生。给社会及数量众多的患儿家庭带来了无法逆转的痛苦和沉重的负担。目前的医学水平对此疾病尚无有效的治疗方法，产前诊断和选择性流产是唯一的预防手段。脆性X-FMR1基因现有的检测技术为AmplideX检测技术。该方法无法检测基因型。传统的检测FMR1基因突变的方法有Southern杂交法和普通PCR法。Southern杂交法费时、费力、DNA需要量大、灵敏度低(5-10％)，无法确定CGG重复数；普通PCR方法成本低，但高GC的片段干扰了了FMR1的扩增。因为大量的CGG重复用二代测序拼接有困难，因此只能用三代或一代进行测序来进行检测。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的上述技术问题，本专利技术人在进行了大量的深入研究之后，提供了一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法。本专利技术提供的方法包括FMR1的引物设计，PCR扩增与三代测序结果分析。本专利技术通过设计高特异性的扩增引物，增加多种扩增增强剂，摸索扩增条件，调整扩增体系，采用三代的分析流程分析FMR1的CGG重复次数。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种基于三代测序的FMR1的检测引物，包括：上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。本专利技术还提供了一种基于三代测序的FMR1的检测体系，包括上述引物。优选地，上述检测体系还包括PCR扩增增强剂；更优选地，所述PCR扩增增强剂包括甘油及DMSO。优选地，所述PCR扩增增强剂中，甘油的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，更优选5％，DMSO的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，更优选2.5％。本专利技术还提供了一种基于三代测序的FMR1的检测方法，包括如下具体步骤：(1)根据人FMR1的DNA序列，跨CGG重复区设计PCR引物；(2)使用步骤(1)中的引物，加入DNA模板、dNTP、PCR扩增增强剂，配制PCR反应mix，扩增FMR1的CGG高重复区；(3)使用步骤(2)得到的PCR扩增产物，毛细管电泳质检条带大小；(4)使用步骤(2)中的PCR扩增产物，加Barcoded，进行三代建库及测序；(5)使用步骤(4)产出的数据，分析出CGG的重复次数。优选地，步骤(1)中，所述引物包括：上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。优选地，步骤(2)中，所述PCR扩增增强剂包括甘油及DMSO。更优选地，所述PCR扩增增强剂中，甘油的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，DMSO的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，更优选2.5％。优选地，步骤(2)中，在预冷的冰板上配制PCR反应mix，即，所述冰板的温度为0-10℃；更优选地，为0℃。优选地，步骤(2)中，10μLPCR反应体系中，所述DNA模板的加入量为10ng-50ng；更优选地，为20ng。优选地，步骤(2)中，扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变性10sec，56-68℃退火30sec，68℃延伸1min50sec，32个循环；68℃延伸5min；4℃保存。更优选地，步骤(2)中，64℃退火30sec。本专利技术以上FMR1扩增步骤中，步骤(1)和(2)对于本专利技术获得高质量的实验结果是至关重要的。本专利技术中由于FMR1中高GC区域难以扩增，因此优选采用64℃退火，加入扩增增强剂(包含2.5％DMSO与5％甘油)。且FMR1基因多为杂合子，扩增产物多为CGG重复少的小片段，因此采用提高模板量降低循环数的方式。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：一步PCR即可获取到FMR1的产物。操作简单方便，耗时短。三代测序直接检测扩增产物全长，可检测样本是否为杂合。附图说明图1：FMR1扩增(不加增强剂)毛细管电泳质检带型图(模板量：10ng，循环数：35cycle)。图2：FMR1扩增(不加增强剂)毛细管电泳质检峰图(模板量：10ng，循环数：35cycle)。图3：FMR1扩增(加增强剂)毛细管电泳质检带型图(1、不加增强剂，2、2.5％DMSO，3、5％甘油，4、2.5％DMSO+5％甘油)(模板量：10ng，循环数：35cycle)。图4：FMR1扩增(加增强剂)毛细管电泳质检带型图(2.5％DMSO+5％甘油，模板量：20ng，循环数：32cycle)。图5：FMR1扩增(加增强剂)毛细管电泳质检峰图(2.5％DMSO+5％甘油，模板量：20ng，循环数：32cycle)。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。在一个具体的实施方式中，本专利技术所述方法的具体步骤为：(1)引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于三代测序的FMR1的检测引物，包括：/n上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，/n下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于三代测序的FMR1的检测引物，包括：
上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，
下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。


2.一种基于三代测序的FMR1的检测体系，其特征在于，包括权利要求1所述的一种基于三代测序的FMR1的检测引物。


3.根据权利要求2所述的一种基于三代测序的FMR1的检测体系，其特征在于，还包括PCR扩增增强剂；优选地，所述PCR扩增增强剂包括甘油及DMSO。


4.根据权利要求3所述的一种基于三代测序的FMR1的检测体系，其特征在于，所述PCR扩增增强剂中，甘油的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，DMSO的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％。


5.一种基于三代测序的FMR1的检测方法，包括如下具体步骤：
(1)根据人FMR1的DNA序列，跨CGG重复区设计PCR引物；
(2)使用步骤(1)中的引物，加入DNA模板、dNTP、PCR扩增增强剂，配制PCR反应mix，扩增FMR1的CGG高重复区；
(3)使用步骤(2)得到的PCR扩增产物，毛细管电泳质检条带大小；
(4)使用步骤(2)中得到的PCR扩增产物，加Barcoded，进行三代建库及测序；
(5)使用步骤(4)产出的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王树伟，肖云平，史贤俊，赵仕兰，洪强，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31