一种基于RT-qPCR诊断结核性溃疡的PCR引物组合、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于RT‑qPCR诊断结核性溃疡的PCR引物组合、试剂盒及其应用。并具体公开了CXCL9基因、CXCL10基因在制备诊断结核性溃疡的产品中的应用；还公开了针对结核性溃疡RT‑qPCR诊断的CXCL9基因和CXCL10基因的PCR引物；还公开了PCR引物组合及应用(以U6为内参基因，基于RT‑qPCR技术检测CXCL9基因和/或CXCL10基因表达水平)：当待检血浆中CXCL9的2

PCR primer combination, kit and its application in the diagnosis of tuberculous ulcer based on RT-qPCR

【技术实现步骤摘要】
一种基于RT-qPCR诊断结核性溃疡的PCR引物组合、试剂盒及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种用于诊断结核性溃疡的PCR引物组合、试剂盒及其应用。
技术介绍
结核性溃疡(Tuberculouslymphadenitis)是指结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)、牛分枝杆菌和卡介苗(BCG)经各种传播路径侵犯机体局部组织，引起病灶周围软组织、皮下及皮肤的坏死，最终液化破溃所形成的创面，属于肺外结核，约占全部肺外结核的30％～40％，是临床最为常见的一种特异性感染性创面。早期诊断，及时干预是结核病控制的有效手段，然而由于分枝杆菌的数量、毒力、传播途径、发病方式及机体免疫力不同，患者的临床表现、发病部位、皮损形态各异，结核性溃疡的诊断存在相当难度。目前临床上诊断结核性溃疡以脓液抗酸杆菌培养及创面组织病理学检查为金标准，辅以γ-干扰素(IFN-γ)释放试验、结核菌素皮肤试验、结核抗体检测等检测手段。但实际应用中脓液抗酸杆菌培养阳性率极低且培养周期较长；创面组织病理学检查属于有创性检查，易出现假阴性且不便于反复取材；而血清学方面的检测特异性、灵敏度并不高。由于结核性溃疡的发病机制尚未明确且临床上与某些慢性难愈性创面表现极为相似，目前尚未发现诊断结核性溃疡的具有较高特异性、灵敏度及快捷方便的检测指标及检测手段。趋化因子CXCL9、CXCL10和结核相关疾病的发病因素密切相关，其多态性的特点在治疗反应、基因调控和疾病转归中发挥重要作用。病毒和细菌感染能影响宿主CXCL9的表达，并且在宿主抗感染免疫中起重要作用，CXCL10由IFN-γ诱导产生，能募集中性粒细胞，促进多种细胞因子分泌，且参与结核等相关感染性疾病的发病，具有趋化单核细胞、活化T细胞、自然杀伤细胞、刺激T细胞黏附内皮细胞的功能。本专利技术人所在课题组在工作前期分析了结核性溃疡与非特异性感染性溃疡组织中的mRNA生物标志物，分析了基因本体论(GO)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)生物途径，免疫、炎症和趋化因子的相关性，发现与非特异性感染性溃疡组织相比，结核性溃疡局部坏死肉芽组织中CXCL9，CXCL10的呈现高表达趋势。基于此，本专利技术人研究了CXCL9、CXCL10在结核性溃疡患者局部病灶组织中的表达情况，共检测经病理组织学证实的96例结核性溃疡组织样本，53例非结核性溃疡(包括压疮、下肢静脉溃疡、糖尿病足等创面)组织样本，发现CXCL9、CXCL10在结核性溃疡组织中呈现高表达并且其表达与抗结核治疗程度明显正相关，可作为诊断结核性溃疡及治疗后复查的独立因素。因此，本专利技术人研究了一种结核性溃疡的血浆诊断试剂盒及检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于RT-qPCR诊断结核性溃疡的PCR引物组合、试剂盒及其应用。为实现上述技术目的，本专利技术采取的技术方案为：本专利技术提供一种基于RT-qPCR诊断结核性溃疡的PCR引物组合，包括检测CXCL9基因的PCR引物、CXCL10基因的PCR引物和U6基因的PCR引物，其中，CXCL9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，CXCL10基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述CXCL9基因的PCR引物为SEQIDNO.3所示的CXCL9-F和SEQIDNO.4所示的CXCL9-R，CXCL10基因的PCR引物为SEQIDNO.5所示的CXCL10-F和SEQIDNO.6所示的CXCL9-R，U6基因的PCR引物为SEQIDNO.7所示的U6-F和SEQIDNO.8所示的U6-R。本专利技术还提供了PCR引物组合在制备结核性溃疡诊断产品中的应用，所述产品包括以U6基因作为内参基因，通过RT-qPCR检测血浆样本中CXCL9基因和/或CXCL10基因的表达水平来诊断结核性溃疡的产品。本专利技术还提供了CXCL9基因、CXCL10基因在制备诊断结核性溃疡的产品中的应用，所述产品包括以U6基因作为内参基因，通过RT-qPCR检测血浆样本中CXCL9基因和/或CXCL10基因的表达水平来诊断结核性溃疡的产品，所述CXCL9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述CXCL10基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种结核性溃疡诊断试剂盒，包括CXCL9基因的PCR引物CXCL9-F/CXCL9-R和U6基因的PCR引物U6-F/U6-R，通过RT-qPCR检测血浆样本中CXCL9基因的表达水平来诊断结核性溃疡。进一步地，以U6基因作为内参基因，通过RT-qPCR检测CXCL9基因的表达水平以诊断结核性溃疡，当检测到待检血浆中CXCL9的2-△Ct值大于等于0.112时，表示患结核性溃疡或存在患结核性溃疡的风险；当检测到待检血浆中CXCL9的2-△Ct值小于0.112时，表示未患结核性溃疡可能性大。本专利技术还提供了一种结核性溃疡诊断试剂盒，包括CXCL10基因的PCR引物CXCL10-F/CXCL10-R和U6基因的PCR引物U6-F/U6-R，通过RT-qPCR检测血浆样本中CXCL10基因的表达水平来诊断结核性溃疡。进一步地，以U6基因作为内参基因，通过RT-qPCR检测CXCL10基因的表达水平以诊断结核性溃疡，当检测到待检血浆中CXCL10的2-△Ct值大于等于4.014时，表示患结核性溃疡或存在患结核性溃疡的风险；当检测到待检血浆中CXCL10的2-△Ct值小于4.014时，表示未患结核性溃疡可能性大。本专利技术还提供了一种结核性溃疡诊断试剂盒，包括上述PCR引物组合，即CXCL9-F/CXCL9-R、CXCL10-F/CXCL10-R和U6-F/U6-R，通过RT-qPCR检测血浆样本中CXCL9基因和CXCL10基因的表达水平来诊断结核性溃疡。进一步地，以U6基因作为内参基因，通过RT-qPCR联合检测CXCL9基因和CXCL10基因的表达水平以诊断结核性溃疡，当检测到待检血浆中CXCL9的2-△Ct值大于等于0.112和/或CXCL10的2-△Ct值大于等于4.014时，表示患结核性溃疡或存在患结核性溃疡的风险；当检测到待检血浆中CXCL9的2-△Ct值小于0.112且CXCL10的2-△Ct值小于4.014时，表示未患结核性溃疡可能性大。上述结核性溃疡诊断试剂盒在制备结核性溃疡诊断产品中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1)本专利技术通过研究结核性溃疡与人体血浆CXCL9基因和CXCL10基因表达的相关性，研究一种结核性溃疡诊断的试剂。本专利技术首次通过检测受试者血浆中CXCL9基因和/或CXCL10基因的表达水平，并分析其在结核性溃疡患者中的诊断效能，从而从RT-qPCR技术的角度，研究一种结核性溃疡的新型诊断试剂。相比传统的检测手段更及时、更特异、更灵敏，能够实现结核性溃疡的早期诊断；2)本专利技术的试剂盒用于临床结核性溃疡的诊断：一种试剂盒通过检测受试者血浆中CXCL9基因的表达水平判断受试者是否患有结核性溃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于RT-qPCR诊断结核性溃疡的PCR引物组合，其特征在于，包括检测CXCL9基因的PCR引物、CXCL10基因的PCR引物和U6基因的PCR引物，其中，CXCL9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CXCL10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CXCL9基因的PCR引物为SEQ ID NO.3所示的CXCL9-F和SEQ ID NO.4所示的CXCL9-R，CXCL10基因的PCR引物为SEQ ID NO.5所示的CXCL10-F和SEQ ID NO.6所示的CXCL9-R，U6基因的PCR引物为SEQ IDNO.7所示的U6-F和SEQ ID NO.8所示的U6-R。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于RT-qPCR诊断结核性溃疡的PCR引物组合，其特征在于，包括检测CXCL9基因的PCR引物、CXCL10基因的PCR引物和U6基因的PCR引物，其中，CXCL9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，CXCL10基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述CXCL9基因的PCR引物为SEQIDNO.3所示的CXCL9-F和SEQIDNO.4所示的CXCL9-R，CXCL10基因的PCR引物为SEQIDNO.5所示的CXCL10-F和SEQIDNO.6所示的CXCL9-R，U6基因的PCR引物为SEQIDNO.7所示的U6-F和SEQIDNO.8所示的U6-R。


2.权利要求1所述的PCR引物组合在制备结核性溃疡诊断产品中的应用，其特征在于，所述产品包括以U6基因作为内参基因，通过RT-qPCR检测血浆样本中CXCL9基因和/或CXCL10基因的表达水平来诊断结核性溃疡的产品。


3.CXCL9基因、CXCL10基因在制备诊断结核性溃疡的产品中的应用，其特征在于，所述产品包括以U6基因作为内参基因，通过RT-qPCR检测血浆样本中CXCL9基因和/或CXCL10基因的表达水平来诊断结核性溃疡的产品，所述CXCL9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述CXCL10基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.一种结核性溃疡诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的CXCL9基因的PCR引物CXCL9-F/CXCL9-R和U6基因的PCR引物U6-F/U6-R，通过RT-qPCR检测血浆样本中CXCL9基因的表达水平来诊断结核性溃疡。


5.根据权利要求4所述的结核性溃疡诊断试剂盒，其特征在于：以U6基因作为内参基因，通过RT-qPCR检测CXCL9基因的表达水平以诊断结核性溃疡...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄子慧，顾宏伟，钱佳燕，张国英，刘万里，施金土，李欣，王旭，朱群，朱敏，颜延凤，陈磊垚，赵璟，张晓阳，孙佳玥，陈晓钰，
申请(专利权)人：南京市中西医结合医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32