检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种检测树鼩NF‑κB基因转录水平的引物、试剂盒及方法，属于分子生物技术领域。本发明专利技术以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用NF‑κB F和NF‑κB R以及GAPDH F和GAPDH R为特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量

Primers, kits and methods for the detection of NF - \u03ba B gene transcription in tree shrews

【技术实现步骤摘要】
检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
NF-κB（核因子κB）参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，是细胞内重要的转录因子。其水平的异常上调将导致多种疾病的发生，是炎症与免疫反应的重要影响因子。急性肾损伤（AKI）以肾功能突然恶化为特征，可通过血清肌酐（SCr）或少尿的增加来诊断。AKI与心血管疾病、慢性肾脏疾病（CKD）和终末期肾脏疾病（ESRD）的风险增加以及死亡率增加相关。据报道，大约一半的脓毒症患者会发生AKI，并将死亡率提高六到八倍。TLR4的激活使NF-κB通路敏感，这与启动促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达有关。TLR4/NF-κB途径的激活已被确定为肾脏炎症的主要诱因。此外，已经证实抑制TLR4/NF-κB介导的炎症反应对LPS诱导的AKI具有肾脏保护作用。抑制TLR4/NF-κB途径的可能机制包括靶向核因子κB激酶抑制剂和抑制其他酶。高尿酸血症将会引起肾损伤，所以研究尿酸对NF-κB的影响具有意义。文献报道中对NF-κB的研究主要集中在其结构、序列、功能上，对转录水平的检测方法的研究国内外未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物、试剂盒及方法，以在转录水平上对NF-κB基因进行定量检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物，包括树鼩NF-κB基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物；其中，树鼩NF-κB基因表达水平的特异性上、下游引物序列如下：NF-κBF：5＇-cagaaattgggcctggggat-3＇；NF-κBR：5＇-ttcagtgtggcccatctgtc-3＇；作为内参基因的树鼩Gapdh基因的特异性上、下游引物序列如下：GAPDHF：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；GAPDHR：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。本专利技术同时提供含有上述检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物的试剂盒。本专利技术还提供上述引物、试剂盒在非诊断目的检测树鼩NF-κB基因转录水平的应用。本专利技术另外提供用于非诊断目的检测树鼩NF-κB基因转录水平的方法，包括如下步骤：步骤（1），分别以健康和待测树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；步骤（2），建立树鼩GAPDH基因及NF-κB基因标准曲线：以Easydilution梯度稀释步骤（1）得到的健康树鼩肾脏组织cDNA第一链，分别以未稀释cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，进行实时荧光定量检测，并分别以NF-κBF和NF-κBR、GAPDHF和GAPDHR为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，分别得到健康树鼩NF-κB基因、GAPDH基因的溶解曲线和扩增曲线；之后以起始模板量拷贝数Log10的对数值为X轴，以Ct值为Y轴进行绘制，分别得到GAPDH基因、NF-κB基因的标准曲线；步骤（3），将步骤（1）得到的待测树鼩肾脏组织cDNA第一链分别以NF-κBF和NF-κBR、GAPDHF和GAPDHR为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，扩增体系和扩增程序与步骤（2）相同，分别得到待测树鼩NF-κB基因、GAPDH基因的溶解曲线和扩增曲线；之后根据步骤（2）得到的标准曲线进行计算，得到树鼩NF-κB基因转录水平。基于实时荧光定量检测的原理，即每个模板的Cq值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下：Cq=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)（n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。）起始拷贝数越多，Cq值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Cq值。因此，获得未知样品的Cq值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。所以根据步骤（2）得到的标准曲线和每个样品的Cq值，利用Bio-RadCFXManager3.1软件中自带的基因表达计算功能就能得到树鼩NF-κB基因转录水平。进一步，优选的是，以Easydilution梯度稀释步骤（1）树鼩肾脏组织cDNA第一链，梯度稀释倍数分别为5倍、25倍、125倍、625倍。进一步，优选的是，实时荧光定量PCR扩增体系下：SYBRPremixExTaqII(2x)5μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板0.8μL，去离子水3.4μL，总计10μL，上、下游引物浓度均为10μM。进一步，优选的是，实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s、60℃退火30s、40个循环。在检测时，当溶解曲线上峰不唯一时，则说明实验中存在污染，需要重新进行检测。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术适用于实时荧光定量PCR检测。应用本专利技术所公开的引物序列可实现对树鼩GAPDH基因及NF-κB基因的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本专利技术的引物可对树鼩NF-κB基因转录水平的变化情况实施定量检测，其操作简单，可重复性高，特异性强，灵敏度好。本专利技术为研究树鼩NF-κB基因的功能及影响因素提供了有效工具。附图说明图1树鼩GAPDH基因的扩增曲线；图2树鼩GAPDH基因的标准曲线；图3树鼩NF-κB基因的扩增曲线；图4树鼩NF-κB基因的标准曲线；图5树鼩GAPDH基因的表达扩增曲线；图6树鼩GAPDH基因的表达熔解峰；图7树鼩NF-κB基因的表达扩增曲线；图8树鼩NF-κB基因的表达熔解峰；图9树鼩NF-κB基因的表达相对表达；图10树鼩NF-κB基因扩增产物胶图，M：maker；1~4为四只不同的树鼩扩增产物胶图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。1、本实施例中所使用的实验动物：树鼩，雌性9只，雄性10只。2、实验动物的分组及给药：将做过空白血清检测的19只树鼩取出1只雄性树鼩待取肾脏组织做标准曲线，剩余18只树鼩随机分成对照组、30天给药组，120天给药组，各6只。雌雄各半，雌性体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物，其特征在于，包括树鼩NF-κB基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物；/n其中，树鼩NF-κB基因表达水平的特异性上、下游引物序列如下：/nNF-κB F：5＇-cagaaattgggcctggggat-3＇；/nNF-κB R：5＇-ttcagtgtggcccatctgtc-3＇；/n作为内参基因的树鼩Gapdh基因的特异性上、下游引物序列如下：/nGAPDH F：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；/nGAPDH R：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。/n

【技术特征摘要】
1.检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物，其特征在于，包括树鼩NF-κB基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物；
其中，树鼩NF-κB基因表达水平的特异性上、下游引物序列如下：
NF-κBF：5＇-cagaaattgggcctggggat-3＇；
NF-κBR：5＇-ttcagtgtggcccatctgtc-3＇；
作为内参基因的树鼩Gapdh基因的特异性上、下游引物序列如下：
GAPDHF：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；
GAPDHR：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。


2.含有权利要求1所述检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物的试剂盒。


3.权利要求1所述的引物、权利要求2所述的试剂盒在非诊断目的检测树鼩NF-κB基因转录水平的应用。


4.用于非诊断目的检测树鼩NF-κB基因转录水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），分别以健康和待测树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
步骤（2），建立树鼩GAPDH基因及NF-κB基因标准曲线：以Easydilution梯度稀释步骤（1）得到的健康树鼩肾脏组织cDNA第一链，分别以未稀释cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，进行实时荧光定量检测，并分别以NF-κBF和NF-κBR、GAPDHF和GAPDHR为特异性引物，进行实时...

【专利技术属性】
技术研发人员：王陈芸，唐东红，叶尤松，李哲丽，李涛，徐瑾，董鑫，张铭娟，黄明峰，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53