靶向治疗血液病恶性肿瘤的研究方法技术

本发明专利技术涉及靶向CD19的嵌合抗原受体逆转录病毒的生产流程及其用途。具体而言，本发明专利技术提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的人的CD8抗原的前导肽、抗CD19单链抗体、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区、人CD28胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白；和(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白。本发明专利技术还提供包装逆转录病毒的过程，以及产毒细胞株的生产过程和筛选单克隆细胞株的过程。本发明专利技术成功制备了表达CD19‑CD28z CAR的种子细胞库，为批量生产靶向CD19逆转录病毒奠定了基础。

Targeted therapy for hematological malignancies

【技术实现步骤摘要】
靶向治疗血液病恶性肿瘤的研究方法
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向CD19的嵌合抗原受体逆转录病毒生产及其用途
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-celllineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，靶向CD19-CART在治疗白血病和淋巴瘤的临床试验中已经取得了很好的疗效。那么在CD19-CART细胞制备工程中的工艺流程如何来优化，是大家关注的热点。CART细胞的生产过程中大多数公司和研究机构多采用瞬时转染病毒(逆转录病毒，慢病毒)的方法来制备，这就带来一个问题，每批病毒的滴度不一样，感染T细胞的效率也不同，无法达到生产过程中要求的均一化。本专利技术采用构建逆转录病毒稳定表达CD19CAR的细胞株的方法来制备CART细胞所用到的逆转录病毒。本专利技术所构建的产毒细胞株，源自PG13细胞株，PG13是来源于TK-NIH/3T3细胞系的逆转录病毒包装细胞株，该细胞株可表达长臂猿白血病病毒(GaLV)包膜蛋白和Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)gag-pol蛋白。是由美国弗雷德哈钦森癌症研究中心和国家心理卫生研究所研究人员于1990年联合构建完成。PG13细胞株可用于生产滴度超过106CFU/ml的逆转录病毒，宿主范围广泛，包括大鼠、仓鼠、牛、猫、狗、猴子和人类细胞。本专利技术成功制备了PG13-CD19-CD28z种子细胞株，为今后批量生产CD19-CD28zCAR病毒奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中用瞬时转染病毒的方法来制备CART细胞技术的不足，提供PG13-CD19-CD28z产毒细胞株的制备方法及应用。为此，本专利技术的解决方案是：本专利技术第一方面提供一种核酸构建物。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为表达载体。在一个或多个实施方案中，所述表达载体为RV逆转录病毒骨架载体。在一个或多个实施方案中，所述RV逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文第二方面所述多核苷酸序列，以及抗性基因。本专利技术第二方面提供一种逆转录病毒的包装，所述逆转录病毒含有本文第三方面所述的RV逆转录病毒骨架载体，以及gag-pol载体和VSVG载体，通过磷酸钙转染法进行逆转录病毒包装。本专利技术第三方面提供一种细胞株PG13，所述感染包装好的逆转录病毒，形成PG13-CD19-CD28z产毒细胞株,CD19-CD28z该核苷酸序列选自：在所述抗CD19单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQIDNO:1第1-63位核苷酸序列所示；和/或所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQIDNO:1第64-384位核苷酸序列所示；和/或所述抗CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:1第430-789位核苷酸序列所示；和/或所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQIDNO:1第790-930位核苷酸序列所示；和/或所述人CD28跨膜区的编码序列如SEQIDNO:1第931-1010位核苷酸序列所示；和/或所述人CD28胞内区的编码序列如SEQIDNO:1第1011-1134位核苷酸序列所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQIDNO:1第1135-1467位核苷酸序列所示的核苷酸序列组成。本专利技术第四方面提供一种单克隆细胞株筛选，所述制备好的PG13-CD19-CD28z产毒细胞株通过有限稀释法进行高表达CD19-CD28zCAR的单克隆细胞株筛选。。本专利技术第五方面提供本文所述的融合蛋白、多核苷酸序列、载体、逆转录病毒或产毒细胞株的制备治疗CD19介导的疾病的药物中的用途。在一个或多个实施方案中，所述CD19介导的疾病包括白血病和淋巴瘤。在一个或多个实施方案中，所述CD19介导的疾病包括B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、和急性髓性白血病。附图说明图1.RV-GPRE载体图谱。WPRE：用于提高病毒转录物的稳定性的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件；EGFR:增强型绿色荧光蛋白。图2.RV-CD19-CD28z载体图谱。SP：信号肽；VL：轻链可变区；Lk：接头(G4S)3；VH：重链可变区；H：CD8α铰链区；TM：CD28跨膜区；WPRE：用于提高病毒转录物的稳定性的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。图3RV-CD19-CD28z逆转录病毒表达质粒的部分测序结果峰值图。图4.PG13细胞株表达CD19-CD28zCAR的效率图。图5.CD19-CD28z病毒液感染293T细胞的效率图。图6.用293T细胞检测筛选出的PG13-CD19-CD28z单克隆细胞株CD19-CD28zCAR表达情况图。图7.用PBMC检测筛选出的PG13-CD19-CD28z单克隆细胞株CD19本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求4所述的多核苷酸序列；/n优选地，所述核酸构建物为载体；/n更优选地，所述核酸构建物为RV逆转录病毒骨架载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，以及权利要求4所述的多核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求4所述的多核苷酸序列；
优选地，所述核酸构建物为载体；
更优选地，所述核酸构建物为RV逆转录病毒骨架载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，以及权利要求4所述的多核苷酸序列。


2.一种逆转录病毒包装，所述逆转录病毒含有权利要求1所述的RV骨架载体，以及gag-pol载体和VSVG载体，通过磷酸钙转染法进行逆转录病毒包装。


3.一种细胞株PG13，所述感染权利要求2所包装好的逆转录病毒，形成PG13-CD19-CD28z产毒细胞株。CD19-CD28z该核苷酸序列选自：
在所述抗CD19单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQIDNO:1第1-63位核苷酸序列所示；和/或
所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQIDNO:1第64-384位核苷酸序列所示；和/或
所述抗CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:1第430-789位核苷酸序列所示；和/或
所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQIDNO:1第790-930位核苷酸序列所示；和/或<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海鹰，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31