一种人Legumain化学发光检测试剂盒及其应用制造技术

一种人Legumain化学发光检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括以下组分：a）链霉亲和素化磁珠悬浮液；b)吖啶酯标记的Legumain抗体；c)生物素标记Legumain抗体；d）化学发光底物液，包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液；e)校准品：浓度为0pg/mL，10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL的Legumain抗原；f）质控品；g)清洗液。本试剂盒以链霉亲和素化磁珠悬浮液作为免疫反应与分离的固相载体，亲和素化的磁性微粒子主要用于与生物素标记的抗体相连，通过免疫反应使其能够捕获靶物质形成免疫复合物。

【技术实现步骤摘要】
一种人Legumain化学发光检测试剂盒及其应用
本专利技术属于免疫诊断
，具体涉及一种人Legumain化学发光检测试剂盒的应用。
技术介绍
卵巢癌是一种妇科常见的恶性肿瘤，其死亡率居所有妇科恶性肿瘤之首，严重危害女性健康；由于卵巢癌早期通常无明显症状且缺乏简便有效的早期诊断方法，因出现症状就诊时约70％的患者已为晚期，晚期患者的且5年生存率为20％-30％，而早期患者的5年生存率为70-90％。因此，卵巢癌的早期检出对其治疗方案的选择及改善患者预后有重要作用。目前，临床上常用的卵巢癌早期检测方法主要有妇科检查、影像学检查和肿瘤标志物检测等。这些方法及相互配合使用时虽然能够对卵巢癌进行准确诊断，但是对设备和操作人员要求较高，提高了检测成本，同时阻碍了卵巢癌早期检测的普及和推广。肿瘤标志物的检测被广泛用于肿瘤早期筛查，糖类抗原125(carbohydrateantigen125，CA125)是卵巢癌诊断中常用的肿瘤标志物，但是其用于卵巢癌诊断时的特异性较低，易出现假阳性等问题，因而需要找到一种新的肿瘤标志物来取代它或与其实现互补。与正常组织相比，Legumain在小鼠和人类多种实体瘤组织中高表达，尤其是在肿瘤细胞、新生血管内皮细胞和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-AssociatedMacrophages，TAMs)中，而在体外培养的相应肿瘤细胞株中却不表达。Liu等最先报道Legumain与肿瘤发生发展有关。他们通过Westernblot和免疫组化分析，发现在多种鼠肿瘤细胞中，Legumain表达增高，而在体外培养的各肿瘤细胞株中则不表达。Liu等还检测了人正常组织及多种实体瘤组织，结果显示在正常组织中，Legumain表达极低，而在多种实体瘤组织中(如乳腺、结肠、肺、前列腺、卵巢肿瘤和中枢神经系统恶性肿瘤)Legumain高表达。侵袭和转移是恶性肿瘤的播散方式，也是影响肿瘤患者的治疗效果和预后的重要因素。Legumain与整合素形成复合物，在实体肿瘤的低氧和酸性微环境中，具有激活肿瘤细胞Pro-MMP2和Pro-CathepsinL的功能，促进肿瘤生长、侵袭和转移。为了证实Legumain的表达是否与肿瘤的分化程度、坏死、凋亡及预后相关。Murthy等通过Westernblot和免疫组织化学方法，对164例原发性结肠癌、34例远端正常粘膜组织、89例癌旁组织及33例淋巴结转移癌组织样本进行临床病理检测，结果表明，在原发性结肠癌中，Legumain表达明显高于远端正常组织和癌旁组织(P<0.05)，但与淋巴结转移癌组织样本无显著差异(P>0.05)。同时，Legumain在肿瘤患者瘤体(P＝0.01)或基质中的表达(P＝0.04)水平较低时，其预后较好。Gawenda等、通过免疫组织化学方法研究了432例乳腺浸润癌和128例乳腺非癌组织样本，证实人乳腺癌组织中Legumain高表达，并且与乳腺癌临床病理变化有一定的相关性。Lin(Linet.al.,JNCI,2014.)等报道了乳腺癌病人细胞内的Legumain在TRAF6的催化下进行泛素化，然后与HSP90α形成复合体被运输到细胞外随血液循环系统到达远端组织，在远端组织进行活化后促进肿瘤的迁移和扩散，并且已证实乳腺癌病人血清中Legumain的水平与癌症的发展阶段呈一定的相关性。血清中的Legumain水平可以促进肿瘤的侵袭和扩散，用抑制剂或者抗体阻断血清中的Legumain作用可以消除小鼠体内肿瘤的扩散。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人Legumain化学发光检测试剂盒的应用，要解决现有技术的试剂盒检测不灵敏的技术问题；并解决现有技术检测结果易受检测条件影响、准确度不高的问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在，所述试剂盒包括以下组分：a)链霉亲和素化磁珠悬浮液；b)吖啶酯标记的Legumain抗体；c)生物素标记Legumain抗体；d)化学发光底物液，包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液；e)校准品：浓度为0pg/mL，10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL的Legumain抗原；f)质控品；g)清洗液。进一步优选地，所述吖啶酯标记的Legumain抗体由以下步骤制备而成：将Legumain抗体放入离心管中室温离心10s-30s，离心后加入碳酸缓冲液，混匀后加入吖啶酯溶液再次进行室室温离心，离心后将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，25℃震荡混匀2-4h，混匀后在离心管中加入封闭液，再次将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀封闭，封闭时间1-2h，将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化、用PB缓冲液洗脱，收集，然后放入缓冲液中稀释，保存吖啶酯标记的Legumain抗体备用。进一步地，所述吖啶酯标记的Legumain抗体中Legumain抗体的质量(μg)﹕吖啶酯溶液的体积(μl)为100﹕1，所述吖啶酯溶液浓度为2mg/mL，所述封闭液为20％的赖氨酸；所述缓冲液为50mMMES、0.05％吐温-20和0.05％Proclin300的混合液，pH＝6。进一步地，所述链霉亲和素化磁珠悬浮液由以下步骤制备而成：1)将氯化铁和氯化亚铁在水中溶解混匀后，加入氨水，在50-70℃下反应3-5h，得到磁性微球；2)将步骤1)得到的磁性微球分散于50％乙醇中，之后同0.5％PEG4000、0.1％氨水和0.1％正硅酸乙酯在60-65℃搅拌反应14h-18h，得到改性后的磁性微球；3)将步骤2)得到的改性后的磁性微球用超纯水和无水乙醇交替洗涤后重悬于50％乙醇中，再分别加入0.05％氨水、0.5％四甲基氢氧化铵TMA和2.5％3-氨丙基三甲氧基硅烷，在室温搅拌反应14h-18h，得表面修饰氨基的磁性微球；4)将步骤3)得到表面修饰氨基的磁性微球用PBS缓冲液清洗并重悬再加入0.1％TMA、2.5％戊二醛在室温下搅拌反应30-40min，之后用碳酸缓冲液清洗并重悬超声分散后按20ug/mg磁性微球加入SA，37℃搅拌反应14h-18h，加入0.1％谷氨酸和1％BSA继续反应1-2h，反应后，利用含0.05％的Tween-20的PBS缓冲液洗涤3次后重悬于1％BSA中超声分散即得SA磁性微球，加入磁微粒保存液于2-8℃保存，得到链霉亲和素化磁珠得到链霉亲和素化磁珠悬浮液备用。进一步地，所述生物素标记Legumain抗体由以下步骤制备而成：利用pH6.5的Tris缓冲液将Legumain抗体透析纯化后，加入已活化的长链磺化生物素，2-8℃反应1-3h，再转入室温继续反应10-30min，最后加入赖氨酸反应10-30min，经纯化，加入等体积甘油和0.1％NaN3或0.1％Proclin300，得到偶联标记物标记的Legumain抗体。进一步地，步骤1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：/n链霉亲和素化磁珠悬浮液；/n吖啶酯标记的Legumain抗体；/n生物素标记Legumain抗体；/n化学发光底物液，包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液；/n 校准品：浓度为0 pg/mL，10 pg/ mL、50 pg/mL、100 pg/mL、500 pg/mL、1000 pg/mL、2500 pg/mL的Legumain抗原；/n质控品；/n清洗液。/n

【技术特征摘要】
1.一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：
链霉亲和素化磁珠悬浮液；
吖啶酯标记的Legumain抗体；
生物素标记Legumain抗体；
化学发光底物液，包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液；
校准品：浓度为0pg/mL，10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL的Legumain抗原；
质控品；
清洗液。


2.如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的Legumain抗体由以下步骤制备而成：将Legumain抗体放入离心管中室温离心10s～30s，离心后加入碳酸缓冲液，混匀后加入吖啶酯溶液再次进行室室温离心，离心后将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，25℃震荡混匀2-4h，混匀后在离心管中加入封闭液，再次将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀封闭，封闭时间1-2h，将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化、用PB缓冲液洗脱，收集，然后放入缓冲液中稀释，保存吖啶酯标记的Legumain抗体备用。


3.如权利要求2所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的Legumain抗体中Legumain抗体的质量(μg)：吖啶酯溶液的体积(μl)为100﹕1，所述吖啶酯溶液浓度为2mg/mL，所述封闭液为20％的赖氨酸；所述缓冲液为50mMMES、0.05％吐温-20和0.05％Proclin300的混合液，pH=6。


4.如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素化磁珠悬浮液由以下步骤制备而成：
1)将氯化铁和氯化亚铁在水中溶解混匀后，加入氨水，在50-70℃下反应3-5h，得到磁性微球；
2)将步骤1)得到的磁性微球分散于50％乙醇中，之后同0.5％PEG4000、0.1％氨水和0.1％正硅酸乙酯在60-65℃搅拌反应14h-18h，得到改性后的磁性微球；
3)将步骤2)得到的改性后的磁性微球用超纯水和无水乙醇交替洗涤后重悬于50％乙醇中，再分别加入0.05％氨水、0.5％四甲基氢氧化铵TMA和2.5％3－氨丙基三甲氧基硅烷，在室温搅拌反应14h-18h，得表面修饰氨基的磁性微球；
4)将步骤3)得到表面修饰氨基的磁性微球用PBS缓冲液清洗并重悬再加入0.1％TMA、2.5％戊二醛在室温下搅拌反应30-40min，之后用碳酸缓冲液清洗并重悬超声分散后按20ug/mg磁性微...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，赵树杰，
申请(专利权)人：南京拂晓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32