一种制造技术

一种

【技术实现步骤摘要】
一种S腺苷同型半胱氨酸偶联物及单克隆抗体制备及应用


[0001]本专利技术涉及生物
领域，特别是涉及一种
S
腺苷同型半胱氨酸偶联物及其单克隆抗体的制备
。

技术介绍

[0002]总同型半胱氨酸浓度极度增高的情况见于高胱氨酸尿症，它是一种罕见的同型半胱氨酸代谢酶遗传性缺陷
。
高胱氨酸尿症的症状表现为智力障碍
、
早期动脉粥样硬化及动静脉血栓
。
除此之外，一些非重度遗传缺陷也会引起总同型半胱氨酸水平的中度增高
。
[0003]研究发现同型半胱氨酸是心血管疾病
(CVD)
风险评估中的重要标志物，现已证明存在已知冠状动脉疾病
(CAD)
情况下，同型半胱氨酸是
CAD
相关死亡的独立标志物
。
表明了同型半胱氨酸水平升高与全部病因死亡率以及心血管疾病死亡率升高具有独立相关性
。
[0004]Hcy
的测定技术已有多种主要有氨基酸色谱分析技术
[
例如高效液相质谱法
(HPLC)]、
荧光分光光度分析技术
、
化学发光技术等均可直接或间接测定标本中
Hcy
水平
。
但是这些技术的共同缺点是耗时操作复杂等
。
目前已将酶联免疫吸附试验
(ELISA)
技术常规用于
Hcy
测定但国内类似技术较欠缺
。/>由于建立
Hcy
的
ELISA
测定技术中的关键是制备
S
腺苷同型半胱氨酸
(SAH)
‑
BSA
偶联物和
SAH
单克隆抗体
(SAH mAb)
故本专利技术对制备
S
腺苷同型半胱氨酸
(SAH)
‑
BSA
偶联物和
SAH
单克隆抗体
(SAH mAb)
进行表述
。
[0005]为此我们提出一种
S
腺苷同型半胱氨酸偶联物及其单克隆抗体的制备
。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供如下技术方案：一种
S
腺苷同型半胱氨酸偶联物，包括
S
腺苷同型半胱氨酸偶联物免疫原和人源化重组质粒，所述
S
腺苷同型半胱氨酸偶联物免疫原中
S
腺苷同型半胱氨酸小分子通过生物偶联试剂与载体偶联获得，偶联多个的
SAH
小分子，引起较高的免疫后鼠尾效价
,
免疫载体优选钥孔血蓝蛋白
,
根据抗体筛选要求，反筛抗体使用的载体应与免疫载体不交叉，反筛载体优选鸡卵清蛋白
。
[0007]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述人源化重组质粒的构建，包括以下步骤：
[0008]S1
：重组抗体基因的获得；所述重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列与人源抗体的
Fc
基因序列进行拼接，制备重组的人源化
SAH6
抗体重链序列
VH
‑
hFc
‑
SAH6
；
[0009]S2
：合成基因片段的两端设计
EcoR I
与
NHE I
酶切位点，以
pFUSE
为载体，获得携带有重组基因的质粒
pFUSE
‑
VH
‑
hFc
‑
SAH6
；合成基因片段的两端设计
EcoR I
与
AvrⅡ酶切位点，以
pFUSE
为载体，获得携带有重组基因的质粒
pFUSE
‑
VL
‑
SAH6
；
[0010]S3
：以
pFUSE
‑
VL
‑
SAH6
和
pFUSE
‑
VH
‑
hFc
‑
SAH6
重组载体共转染宿主细胞，表达完整的
IgG
抗体；所述重组系统质粒在共转染宿主细胞后表达抗体；所述
pFUSE
载体骨架包含启动子和信号肽，启动子为
CaMV
，信号肽选自外源蛋白的信号肽
IL2
或
Igkappa。
[0011]一种单克隆抗体的制备，其特征在于：包括如下步骤：
[0012]步骤
a
：
[0013]S
腺苷同型半胱氨酸的活化：将
S
腺苷同型半胱氨酸小分子至于容器中，并依次加入二甲亚砜
、1
‑
乙基
‑3‑
(
‑3‑
二甲氨丙基
)
碳二亚胺和
N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应
30
分钟；
[0014]步骤
b
：
[0015]抗原的偶联和纯化：将鸡卵清蛋白
、
牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白溶解于
3.0mL 0.01M pH
＝
7.4
的磷酸缓冲液中得到溶液
A
，将步骤
a
活化的
S
腺苷同型半胱氨酸滴加到所得的溶液
A
中，在2～
8℃
条件下搅拌
12
‑
16
小时，得到偶联的
S
腺苷同型半胱氨酸抗原，将得到的偶联的
S
腺苷同型半胱氨酸抗原进行透析纯化，得到
S
腺苷同型半胱氨酸免疫抗原和反筛抗原
。
[0016]步骤
c
：
[0017]采用步骤
b
得到的
S
腺苷同型半胱氨酸免疫抗原免疫动物，鼠尾血清经过检测
ELISA
和小分子竞争
ELISA
，确定需要融合的小鼠编号，取其脾脏细胞与
SP2/0
骨髓瘤细胞融合，经过
SAH
反筛抗原多轮筛选，得到一株
S
腺苷同型半胱氨酸特异性单克隆抗体
SAH6
‑
FX
[0018]作为本专利技术的一种优选技术方案所述抗
S
腺苷同型半胱氨酸特异性单克隆抗体的序列，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的碱基序列为
SEQ ID NO:1
，轻链可变区碱基序列为
SEQ ID NO:2。
[0019]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述人源本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
S
腺苷同型半胱氨酸偶联物，其特征在于：包括
S
腺苷同型半胱氨酸偶联物免疫原和人源化重组质粒，所述
S
腺苷同型半胱氨酸偶联物免疫原中
S
腺苷同型半胱氨酸小分子通过生物偶联试剂与载体偶联获得，偶联多个的
SAH
小分子，引起较高的免疫后鼠尾效价
,
免疫载体优选钥孔血蓝蛋白
,
根据抗体筛选要求，反筛抗体使用的载体应与免疫载体不交叉，反筛载体优选鸡卵清蛋白
。2.
根据权利要求1所述的一种
S
腺苷同型半胱氨酸偶联物，其特征在于：所述人源化重组质粒的构建，包括以下步骤：
S1
：重组抗体基因的获得；所述重链可变区的碱基序列和轻链可变区碱基序列与人源抗体的
Fc
基因序列进行拼接，制备重组的人源化
SAH6
抗体重链序列
VH
‑
hFc
‑
SAH6
；
S2
：合成基因片段的两端设计
EcoRI
与
NHEI
酶切位点，以
pFUSE
为载体，获得携带有重组基因的质粒
pFUSE
‑
VH
‑
hFc
‑
SAH6
；合成基因片段的两端设计
EcoRI
与
AvrⅡ酶切位点，以
pFUSE
为载体，获得携带有重组基因的质粒
pFUSE
‑
VL
‑
SAH6
；
S3
：以
pFUSE
‑
VL
‑
SAH6
和
pFUSE
‑
VH
‑
hFc
‑
SAH6
重组载体共转染宿主细胞，表达完整的
IgG
抗体；所述重组系统质粒在共转染宿主细胞后表达抗体；所述
pFUSE
载体骨架包含启动子和信号肽，启动子为
CaMV
，信号肽选自外源蛋白自身的天然信号肽
、IL2、Igkappa
或
hGHRH。3.
一种单克隆抗体的制备，其特征在于：所述单克隆抗体的制备具体为抗
S
腺苷同型半胱氨酸特异性单克隆抗体，包括如下步骤：步骤
a
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘雷，王文枞，赵树杰，
申请(专利权)人：南京拂晓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：