一种聚乙烯亚胺抗原及其制备方法技术

本发明专利技术属于抗体制备技术领域，尤其涉及一种聚乙烯亚胺抗原及其制备方法。方法包括：S1、将聚乙烯亚胺、4

【技术实现步骤摘要】
一种聚乙烯亚胺抗原及其制备方法


[0001]本专利技术涉及抗体制备
，特别涉及一种聚乙烯亚胺抗原及其制备方法。

技术介绍

[0002]聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)又称聚氮杂环丙烷，是一种合成型水溶性高分子聚合物，表面具有丰富的正电荷，能够有效吸附表面带负电荷的物质。研究表明，PEI可缩合质粒DNA为带正电荷的微粒，这些微粒可以黏合到带负电荷的细胞表面残基，通过胞吞作用进入细胞，而不需受体介导就可转染细胞，而且PEI
‑
DNA复合物能很好地抵御溶酶体的降解作用，有效提高转染效率，因此，PEI转染试剂作为生物载体材料已广泛应用在细胞和基因治疗药物领域，成为了生物载体材料领域的研究热点。而且，PEI具有较强的蛋白质结合性能，可以携带抗原蛋白被抗原提呈细胞识别并引起免疫反应，在提高抗原交叉提呈效果的同时也能够显著降低细胞毒性，有助于提高免疫治疗效果，是一种优良的治疗性肿瘤疫苗的纳米载体系统。虽然PEI具有毒性相对低、成本低、免疫原性低等特点，但是PEI在体内不易生物降解，其富集之后易引起细胞膜通透性增加、线粒体膜电位下降、溶酶体酸性环境破坏、细胞核固缩等多种亚细胞毒性，进一步还会诱导细胞自噬。因此，需要严格控制PEI的用量，准确测定溶液中PEI的含量具有重要意义。
[0003]由于PEI带大量正电荷，极性强，在反相色谱系统上没有保留，且PEI没有显著的紫外吸收基团，无法采用常规紫外检测器检测。现有的测定PEI浓度的方法常采用PEI与Cu
2+
螯合体系，聚乙烯亚胺能够迅速与Cu
2+
发生络合反应，形成一种比较稳定的螯合物体系，PEI
‑
Cu
2+
螯合体系在紫外区、可见光区均产生吸收峰，该络合物可用紫外
‑
可见分光光度计测定，结合高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等可以将PEI
‑
Cu
2+
信号从Cu
2+
信号中分离出来并定量浓度；但该方法的重现性差，而且HPLC和GC等涉及大型仪器设备，操作过于繁琐、样品制备复杂、检测成本高，不适合进行大规模的推广及应用。因此，缺少高通量、简单快速的PEI含量检测方法。
[0004]基于抗原抗体特异性识别的免疫分析方法可以定性定量检测样品中的特定物质残留，这种分析方法对仪器设备要求不高、快速简便，一般无需对样品进行复杂的预处理，而且灵敏度高、特异性强，对使用人员的专业技术要求不高，容易普及和推广，可满足快速分析检测的需要，尤其适宜大量样品的快速分析。免疫分析方法的关键在于制备出特异性强的抗体。由于PEI为小分子化合物，无有效的免疫原性，直接免疫动物后无法得到有效的抗体，因此，目前鲜有PEI抗体产品的研究报道。开发一种免疫原性强的PEI抗原的合成方法，并利用该抗原制备得到高特异性的针对PEI的抗体是亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种聚乙烯亚胺抗原的制备方法，并提供了由该方法制备得到的聚乙烯亚胺抗原和含有该聚乙烯亚胺抗原的免疫原性组合物，以解决现有技术中重组抗体核酸残留以及抗体纯化过程中聚集体形成的技术问题。
[0006]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术第一方面提供了一种聚乙烯亚胺抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0008]S1、将聚乙烯亚胺、4
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羟基
‑
2,2,6,6
‑
四甲基哌啶1
‑
氧基自由基和催化剂加入到溶剂A中溶解，进行氧化反应，反应完成后真空浓缩抽干，得到末端醛基修饰聚乙烯亚胺；
[0009]所述聚乙烯亚胺的结构式如式(1)所示：
[0010][0011]所述末端醛基修饰聚乙烯亚胺的结构式如式(2)所示：
[0012][0013]S2、将所述末端醛基修饰聚乙烯亚胺和巯基
‑
聚乙二醇
‑
羟胺溶于溶剂B中，加入pH调节剂，进行肟化反应，反应完成后纯化得到末端巯基修饰聚乙烯亚胺；
[0014]所述巯基
‑
聚乙二醇
‑
羟胺的结构式如式(3)所示：
[0015][0016]所述末端巯基修饰聚乙烯亚胺的结构式如式(4)所示：
[0017][0018]S3、将马来酰亚胺活化载体蛋白和所述末端巯基修饰聚乙烯亚胺溶于溶剂C中，进行迈克尔加成反应，反应完成后纯化得到载体蛋白偶联聚乙烯亚胺；
[0019]所述马来酰亚胺活化载体蛋白的结构式如式(5)所示：
[0020][0021]所述载体蛋白偶联聚乙烯亚胺的结构式如式(6)所示：
[0022][0023]上述式中，n为大于或等于2的任意自然数，m为大于或等于1的任意自然数，k为大于或等于1的任意自然数，carrier protein表示载体蛋白。
[0024]进一步地，步骤S1中，所述聚乙烯亚胺、所述4
‑
羟基
‑
2,2,6,6
‑
四甲基哌啶1
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氧基自由基和所述催化剂摩尔比为1：0.01
‑
0.1：0.15
‑
0.5。
[0025]进一步地，步骤S1中，所述催化剂选自Fe(NO3)3，所述溶剂A选自乙腈，所述溶剂A中所述聚乙烯亚胺的摩尔浓度为0.05
‑
5mol/L。
[0026]进一步地，步骤S1中，在室温进行氧化反应3
‑
8h。
[0027]进一步地，步骤S2中，所述末端醛基修饰聚乙烯亚胺和所述巯基
‑
聚乙二醇
‑
羟胺摩尔比为1：1。
[0028]进一步地，步骤S2中，所述pH调节剂选自醋酸，所述溶剂B选自水，所述溶剂B中所述末端醛基修饰聚乙烯亚胺的摩尔浓度为1
‑
10mol/L。
[0029]进一步地，步骤S2中，加热回流10
‑
30min进行肟化反应，加热温度为90
‑
100℃。
[0030]进一步地，步骤S3中，所述马来酰亚胺活化载体蛋白和所述末端巯基修饰聚乙烯亚胺摩尔比为1：1
‑
3。
[0031]进一步地，步骤S3中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔血蓝蛋白中的一种，所述溶剂C选自TBS缓冲液，所述溶剂C中所述末端巯基修饰聚乙烯亚胺的摩尔浓度为5
‑
10mol/L。
[0032]进一步地，步骤S3中，室温进行迈克尔加成反应2
‑
3h。
[0033]进一步地，步骤S2和步骤S3中，纯化方法包括透析或超滤处理。
[0034]本专利技术第二方面提供了一种聚乙烯亚胺抗原，由如上所述的聚乙烯亚胺抗原的制备方法制备得到。
[0035]本专利技术第三方面提供本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种聚乙烯亚胺抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将聚乙烯亚胺、4
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羟基
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2,2,6,6
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四甲基哌啶1
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氧基自由基和催化剂加入到溶剂A中溶解，进行氧化反应，反应完成后真空浓缩抽干，得到末端醛基修饰聚乙烯亚胺；S2、将所述末端醛基修饰聚乙烯亚胺和巯基
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聚乙二醇
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羟胺溶于溶剂B中，加入pH调节剂，进行肟化反应，反应完成后纯化得到末端巯基修饰聚乙烯亚胺；S3、将马来酰亚胺活化载体蛋白和所述末端巯基修饰聚乙烯亚胺溶于溶剂C中，进行迈克尔加成反应，反应完成后纯化得到载体蛋白偶联聚乙烯亚胺；所述载体蛋白偶联聚乙烯亚胺的结构式如式(6)所示：式中，n为大于或等于2的任意自然数，m为大于或等于1的任意自然数，k为大于或等于1的任意自然数，carrier protein表示载体蛋白。2.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺抗原的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述聚乙烯亚胺、所述4
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羟基
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2,2,6,6
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四甲基哌啶1
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氧基自由基和所述催化剂摩尔比为1：0.01
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0.1：0.15
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0.5。3.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺抗原的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述催化剂选自Fe(NO3)3，所述溶剂A选自乙腈，所述溶剂A中所述聚乙烯亚胺的摩尔浓度为0.05
‑
5mol/L。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：余乐，刘佩佩，
申请(专利权)人：优睿赛思武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：