抗人CD40蛋白的人源化抗体、制备方法及其应用技术

本申请公开了抗人CD40蛋白的人源化抗体、制备方法及其应用。该人源化抗体是通过对抗人CD40兔源亲本抗体进行人源化改造获得，改造方法为：将轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的骨架区(FR)的氨基酸序列进行替代、新增或去除，以获得目标序列。该人源化抗体能够识别人CD40蛋白，和人CD40蛋白的结合活性与CD40L相当；所述人源化抗体和重组表达的人CD40蛋白结合的亲和常数为9.69

【技术实现步骤摘要】
抗人CD40蛋白的人源化抗体、制备方法及其应用


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及抗人CD40蛋白的人源化抗体、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]人CD40蛋白是一种I型跨膜糖蛋白，由N端信号肽(20aa)、胞膜外区(193aa)、跨膜区(22aa)和胞浆区(62aa)组成。CD40蛋白广泛表达于免疫细胞表面，包括B细胞、T细胞，单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，是细胞表面重要的功能蛋白，参与多种免疫细胞的激活。同时也表达于部分非免疫细胞的表面如上皮细胞。另外，CD40蛋白还表达于白血病B细胞上，且在某些癌症细胞，比如上皮癌细胞表面也有表达。
[0003]人CD40蛋白的配体CD40L(也称CD154)，CD40L主要表达于活化的CD4+T淋巴细胞表面，提供B淋巴细胞活化所必需的协同刺激信号。受体细胞被激活后，表达在细胞表面的CD40L随后会被切下来流入血液，产生一个仍具有生物活性、可溶性的、三聚态的片段，又称为可溶性CD40L。
[0004]CD40
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CD40L共刺激途径对于胸腺依赖的体液免疫十分重要，B细胞的激活，分化以及免疫记忆都离不开该共刺激途径。同时对激活抗原提呈细胞(APC)也非常重要，是T细胞激活的关键。
[0005]其他表达CD40蛋白的免疫细胞被激活后，会分泌多种的细胞因子，发挥不同的免疫功能。比如，巨噬细胞会分泌TNF
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α，树突状细胞和巨噬细胞会分泌白细胞介素12，这些细胞因子对与T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤免疫作用十分重要。
[0006]正是因为CD40蛋白在免疫系统中发挥的重要作用，使得CD40成为免疫细胞共刺激分子中最有潜力的靶点之一。国内外制药企业都有布局CD40激动剂抗体的开发，目前进入临床二期7个，临床一期6个，主要适应症为黑色素瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌等，用药方式有单独用药，也有和其他治疗方式联合用药。
[0007]开发针对CD40高亲和力的兔单克隆抗体，有助于提高对CD40蛋白检测的精确性。另外，已有的CD40激动剂抗体大多源于鼠单克隆抗体，亲和力相对较弱，开发高亲和力、高激活活性的兔单克隆抗体，可以给基于CD40靶点的治疗性抗体提供新的选择。
[0008]兔源抗体上市药物较少只有美国诺华的Broluzuzumab用于治疗与年龄相关的湿性黄斑变性和丹麦灵北制药Eptinezumab用于预防成人偏头痛两款，可参考的案例偏少，且CDR区相较人源鼠源抗体而言更长改造难度更大。
[0009]提高抗体人源化水平是显著降低亲本兔源单克隆抗体免疫原性的关键，然而人源化水平的提高则极易导致抗体亲和力和特异性的降低。如何平衡抗体人源化水平和亲和力、特异性的维持，是抗体人源化改造的技术难点，也是困扰人源化抗体临床应用的主要问题。

技术实现思路

[0010]为解决或缓解上述部分技术问题，本申请提供了一种抗人CD40蛋白的人源化改造抗体，该人源化抗体在兔源单克隆抗体氨基酸序列基础上，通过基因工程技术将其部分或全部为人源序列取代而重新表达的抗体，该抗体同时保留亲本兔源单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有应用于人体临床。抗体的可变区是其维持亲和力和特异性的功能区，特别是其中的抗体互补决定区(CDR)是在抗体骨架区(FR)的支持下与抗原分子上的表位氨基酸相互作用，决定了抗原的特异性和亲和力。本申请通过对抗人CD40蛋白兔源单克隆抗体的FR区改造后，获得了一种全新的抗人CD40蛋白人源化抗体，保持抗体特异性和亲和力的同时，最大程度地提高了人源化水平。本申请提供的人源化抗体能够识别人CD40蛋白，和人CD40蛋白的结合活性与CD40L相当；所述人源化抗体和重组表达的人CD40蛋白结合的亲和常数为9.69
×
10
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10
M，相较于亲本兔源抗体亲和常数(为5.99
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M)更高；所述抗体能够和人B细胞表面表达的CD40结合，并且激活B细胞，相同实验条件下，激活效果与亲本兔源抗体相当。具体的技术方案主要为：
[0011]第一方面，本申请提供了一种抗人CD40蛋白兔源单克隆抗体的改造抗体，其特异性结合人CD40蛋白，所述抗体通对所述抗人CD40蛋白兔源单克隆抗体的抗体骨架区(FR)进行改造获得，所述改造包括碱基的替代、新增或去除；其中，所述抗体包含：
[0012]根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VL CDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
[0013]和/或
[0014]包含根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VH CDR2，其由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VH CDR3，其由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；优选地，所述置换为保守性置换。
[0015]进一步地，所述抗体包括：
[0016]包含有四个骨架区(FR区)的轻链可变区(VL)；轻链可变区(VL)的四个骨架区分别为：
[0017]L
‑
FR1区；其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
[0018]L
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FR2区；其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
[0019]L
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FR3区；其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
[0020]L
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FR4区；其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
[0021]和/或
[0022]包含有四个骨架区(FR区)的重链可变区(VH)；重链可变区(VH)的四个骨架区分别为：
[0023]H
‑
FR1区；其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
[0024]H
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FR2区；其氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
[0025]H
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FR3区；其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
[0026]H
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FR4区；其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
[0027]第二方面，本申请提供了一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白；所述抗体：包含根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VL CDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；和/或包含根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VH CDR2，其由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VH CDR3，其由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；优选地，所述置换为保守性置换。2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包括：包含有四个骨架区(FR区)的轻链可变区(VL)；轻链可变区(VL)的四个骨架区分别为：L
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FR1区；其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；L
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FR2区；其氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：程昊，娄阳，陈嘉琛，贤加欢，肖航，柳阳，
申请(专利权)人：优睿赛思武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：