一种同时检测CYP2C9和VKORC1基因的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因‑1639 G>A位点的试剂盒及其应用，可同时检测CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因‑1639 G>A位点的多态性，成本低廉，结果直观，能作为血液抗凝治疗者服用华法林的初始剂量和维持剂量的参考。本发明专利技术可结合INR检测值调整维持剂量，能显著降低华法林用药的副反应和风险。

A kit for simultaneous detection of CYP2C9 and VKORC1 genes and its application

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测CYP2C9和VKORC1基因的试剂盒及其应用
本专利技术涉及分子检测领域，具体涉及一种用于检测CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因-1639G>A位点的试剂盒及其应用。
技术介绍
CYP2C9是细胞色素P450酶(CYP)第二亚家族中的重要成员，占肝微粒体P450蛋白总量的20％。CYP2C9参与体内多种药物的羟化代谢。CYP2C9基因具有遗传多态性，人类最常见的等位基因有3种，即野生型CYP2C9*1及突变型CYPC2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)，2种突变型等位基因均可导致CYP2C9酶活性降低，其中CYP2C9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体(携带CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4～6％。CYP2C9*2等位基因在亚洲和中国汉族人群中罕见。CYP2C9*3等位基因在中国人群中的频率约为3％。CYP2C9遗传多态性导致其酶活性变化，从而导致药物代谢种族和个体差异现象。华法林是临床上常用的抗凝药物，是深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换术和肺栓塞等疾病的一线用药，其临床疗效和不良反应存在很大的个体差异，血药浓度过高或敏感性增加可导致严重出血事件。华法林由S-和R-两种消旋体构成，其中S-华法林的抗凝活性约为R-华法林的5倍。85％以上的S-华法林在体内经CYP2C9代谢为无活性的代谢产物，CYP2C9*3纯合子和杂合子基因型个体S-华法林的口服清除率分别下降90％和66％，因此华法林的给药剂量需相应降低。美国FDA推荐在使用华法林前进行CYP2C9基因检测。测定CYP2C9*3等位基因可用于指导中国人群确定华法林的起始用药剂量，并预测药物毒性，结合国际标准化比值(Internationalnormalizedratio，INR)检测值，估计华法林的维持剂量，确保用药安全。维生素K环氧化物还原酶是华法林抗凝作用的靶点，它是维生素K依赖性凝血因子生成过程中的限速酶，其阻碍维生素K由环氧化物形式转化成氢醌形式，从而阻断凝血因子的活化从而产生抗凝作用。维生素K环氧化物还原酶复合物1的编码基因VKORC1(vitaminKepoxidereductasecomplexsubunit1)启动子区(-1639G>A)的单核苷酸突变-1639G>A可影响VKORC1的表达，从而影响华法林的敏感性，是导致华法林用药剂量个体差异的主要原因之一。与该位点AA基因型患者相比，-1639GA和GG基因型患者平均华法林剂量分别增加52％(95％CI：41～64％)和102％(95％CI：85～118％)。VKORC1多态性对华法林剂量影响的比重因种族而异，-1639GA和GG基因型对白种人华法林剂量的影响比对亚洲人的影响分别高10％和50％。总体上，VKORC1多态性在不同种族不同人群中可解释约27％华法林用药剂量的个体差异。VKORC1-1639A等位基因在亚洲人、白种人和黑种人群中的等位基因频率分别为91.17％、38.79％和10.81％，其频率分布的种族差异与华法林用药剂量差异间具有很好的相关性。目前用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的方法包括PCR-Sanger测序法、PCR-焦磷酸测序法、等位基因特异性PCR法、荧光PCR法、PCR-高分辨率熔解曲线法、PCR-基因芯片法、PCR-限制性片段长度多态性方法等。PCR-Sanger测序法先进行PCR扩增，获得跨越靶位点的PCR产物，然后纯化PCR产物，再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。它是基因多态性位点检测的金标准。但对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢。等位基因特异性PCR法的反应体系里含两条等位基因特异的引物和一条公用引物，两条等位基因特异的引物只在3'端最后一个碱基存在差异，其他部分碱基序列完全一样。引物3'端的差异(特异)碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的对应碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3',5'-磷酸二酯键形成障碍而受阻，故此法又称扩增受阻突变体系(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)。其扩增结果为：“野生”模板阻碍,“突变”引物放大；或“突变”模板阻碍,“野生”引物放大。ARMS-PCR点突变的检出率依赖于反应条件的优化和防止引物与靶DNA错配时可能发生的错配延伸。PCR-限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)法是最早用于基因分型的经典方法之一，现在仍被广泛采用。该方法主要基于某些限制性内切酶可以特异性识别某一特定序列的DNA并对其进行剪切的原理。由于限制性内切酶识别序列的严格性，一个碱基的变化就可以导致酶切活性的消失。利用这一特性，若待分型的SNP位点在某一限制性内切酶的识别位点上，将会导致该酶只对其中的一种等位基因具有酶切活性。VKORC1基因-1639G>A位点可直接采用PCR-RFLP法进行检测，因为其多态位点相关序列为CCRG(R＝G/A)，可由MspI(识别序列CCGG)加以甄别，但现有方法由于缺乏酶切内对照序列，当酶切不完全时，GG型样品易被当作GA型样品对待；当酶未发挥作用时，GG、GA型样品易被当作AA型样品对待，极易出现假阳性，因此该位点基于PCR-RFLP法的分型方法有待改进。此外，现有技术使用PCR-RFLP法检测CYP2C9基因A1075C、VKORC1基因-1639G>A这2个位点时，通常使用基因组DNA作为模板，每个样品需要建立2个PCR反应体系分别进行CYP2C9基因A1075C位点及VKORC1基因-1639G>A的PCR，2个位点相应的PCR产物要分别建立2个酶切反应体系各自进行酶切，酶切后每个样品的2种酶切产物(相应于2个位点)要分别在2个电泳体系进行电泳，因为CYP2C9基因A1075C位点的酶切产物通常需要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳或高浓度琼脂糖凝胶电泳进行检测，VKORC1基因-1639G>A位点的酶切产物采用常规的琼脂糖凝胶电泳检测即可。仅从内切酶的使用来讲，有使用NsiI、MspI这2种酶的，也有使用KpnI、MspI这2种酶的，无论哪种组合，都涉及到2种酶，因此也必然会涉及2个PCR反应体系、2个酶切反应体系，操作相对繁琐。
技术实现思路
本专利技术目的在于改进现有PCR-RFLP法检测同一样品的CYP2C9基因A1075C位点、VKORC1基因-1639G>A位点无法在同一反应体系进行PCR和酶切的缺点，同时改进现有单独针对每个位点的RFLP法容易造成假阳性、假阴性或者电泳繁琐的缺点，同时检测CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因-1639G>A位点的多态性，并作为血液抗凝治疗者服用华法林的初始剂量和维持剂量的参考。结合INR检测值调整维持剂量，可显著降低华法林用药的副反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测双位点基因的检测试剂盒，其特征在于，包括CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因-1639G>A位点的扩增引物组、限制酶和PCR试剂；/n其中，CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因-1639G>A位点的扩增引物序列为：/nCYP2C9基因A1075C位点外侧引物对：/nF1：GTGTTATTATTGATAAGTAAGGACTTACCCA；/nR1：TAGCAAAGTTGACAGATTAACATCATCAGA；/nCYP2C9基因A1075C位点内侧引物对：/nF2：CTTCCTGTCTTCCTTTATTGAAGAGAATTTTCTCCACT；/nR2：GTAAATGAATTTTCTGTAGTAGGTGGGGAGAAGGTCCA；/nVKORC1基因-1639G>A位点外侧引物对：/nF3：CACACTCTCTAGAAGAGAGTAGATGTGAG；/nR3：GGGCCAGATGAGGTCTCTCC；/nVKORC1基因-1639G>A位点内侧引物对：/nF4：CTCTCTAGAAGAGAGTAGATGTGAGAAACAGCATCTGGA；/nR4：GTCTTAAACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTGG；/n限制酶为限制性核酸内切酶Mva I或其同裂酶。/n...

【技术特征摘要】
1.一种同时检测双位点基因的检测试剂盒，其特征在于，包括CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因-1639G>A位点的扩增引物组、限制酶和PCR试剂；
其中，CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因-1639G>A位点的扩增引物序列为：
CYP2C9基因A1075C位点外侧引物对：
F1：GTGTTATTATTGATAAGTAAGGACTTACCCA；
R1：TAGCAAAGTTGACAGATTAACATCATCAGA；
CYP2C9基因A1075C位点内侧引物对：
F2：CTTCCTGTCTTCCTTTATTGAAGAGAATTTTCTCCACT；
R2：GTAAATGAATTTTCTGTAGTAGGTGGGGAGAAGGTCCA；
VKORC1基因-1639G>A位点外侧引物对：
F3：CACACTCTCTAGAAGAGAGTAGATGTGAG；
R3：GGGCCAGATGAGGTCTCTCC；
VKORC1基因-1639G>A位点内侧引物对：
F4：CTCTCTAGAAGAGAGTAGATGTGAGAAACAGCATCTGGA；
R4：GTCTTAAACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTGG；
限制酶为限制性核酸内切酶MvaI或其同裂酶。


2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒检测方法包括以下步骤：
1)采集样品；
2)使用外、内引物对进行PCR扩增；
3)对PCR产物进行酶切；
4)...

【专利技术属性】
技术研发人员：何震宇，朱天亮，杨红，钟其恩，陈瑜丽，翟子健，周颖乔，陈晓淼，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44