一种苦豆子SaMET6基因的克隆及应用属基因工程技术领域，本发明专利技术从苦豆子酵母表达文库中通过模拟逆境胁迫筛选出与抗盐相关的苦豆子基因，通过生物信息学分析确定其为苦豆子半胱氨酸甲基转移酶基因SaMET6，利用RT‑PCR技术进行定量检测发现该基因在苦豆子的根、茎、叶片中均有表达，其中在根中表达量最高，且在盐处理条件下，根中表达量明显变化。将该基因通过构建酵母表达载体和植物表达载体并成功转化酵母BY4743和拟南芥中进行功能验证，结果表明该基因在酵母和拟南芥中过表达后能够明显提高其耐盐性和耐旱性，这为我们通过基因工程技术提高作物的抗逆性提供了新的基因资源。
Cloning and application of a samet6 gene from Sophora alopecuroides
【技术实现步骤摘要】
一种苦豆子SaMET6基因克隆及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，涉及利用酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeINVSc1表达筛选与植物抗逆(具体为盐和干旱)相关的基因SaMET6，同时采用实时荧光定量PCR(实时PCR，Real-Time-PCR，)的方法来研究该基因对非生物胁迫NaCl和PEG的功能。
技术介绍
土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球约有20％的耕地受到盐害威胁，43％的耕地为干旱、半干旱地区。逆境胁迫是影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。农作物在生长发育过程中，受到各种逆境因素的影响，包括生物胁迫和非生物胁迫，其中非生物胁迫包括盐、碱、高温、低温、干旱等，这些胁迫限制了植物的生长发育，最终导致作物的产量降低，品质下降，甚至直接影响威胁到粮食安全，在这些影响作物生产的逆境因子当中，高盐碱、干旱、营养失调(包括矿物质缺乏和矿物质中毒)、高温和低温是影响作物产量的主要因素，每年由于盐、碱、干旱、高温和低温胁迫等逆境造成的农作物减产仍然超过总产量的20％，而干旱和盐胁迫是最主要的限制因素。因此，提高作物的耐盐耐旱能力，已经成为作物育种急需解决的关键问题之一。目前通过基因工程的方法进行逆境相关基因的克隆及其功能的解析，能够为植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。然而，从直接解决农业生产中关键问题的角度来看，在农业生产上能起显著作用的转基因作物种类还不多，人类对植物逆境适应性分子机理的研究还远远不够，远不能满足植物分子育种的需求，同世界发达国家相比，我国拥有自主知识产权和具有重要利用价值的基因相对较少。所以，以旱生、耐盐碱植物为研究材料，从中分离克隆得到耐盐，耐旱性显著的基因，是获得抗性基因资源的有效方法，能够为通过基因工程提高作物对生物和非生物胁迫耐受性研究方法提供更多的候选基因。苦豆子(Sophoraalopecuroidesl)为豆科槐属植物，别名苦豆草，是多年生草本植物，根茎地下芽旱生耐盐植物。多生于干旱沙漠和草原边缘地带。主要分布在我国内蒙古西部、新疆、甘肃等干旱地区，具有较强的耐旱、耐盐能力。苦豆子主要生于沙质土壤上，耐沙埋、抗风蚀，具有良好的沙生特点，由于水分活动频繁，植物根系伸展的深而广，在结构紧密的土壤内，因其水分上下移动不畅，植物根系较浅。在半固定沙丘上，苦豆子多为先锋种，当流动沙丘固定后首先生长的即苦豆子。苦豆子不仅是优良的固沙植物与可利用牧草，还是重要的药用植物资源，用途广泛，资源丰富，开发利用价值极高。酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)具有典型的真核系统，是二倍体，它在蛋白翻译后加工过程中能形成二硫键，具有糖基化以及蛋白折叠等特征，使得其基因表达模式更加接近于真核植物中的表达模式，它还具有生长快速、遗传操作简便和易于培养等的优点，所以在对植物功能基因的相关研究中，用酵母表达系统筛选具有原核表达系统不可替代的优势性。酿酒酵母菌株INVSc1(基因型为MATahis3D1leu2trp1-289ura3-52)是经过人工改造后的尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株的酵母转化子运用SC-U缺培养基筛选时，假阳性低，转化效率高，因此是理想的酵母表达菌株。利用酵母营养缺陷型菌株对植物cDNA文库的研究和挖掘，在植物中受到越来越多关注。Frommer等和Hsu等(1993年)在筛选拟南芥cDNA文库中克隆到氨基酸透过酶的NAT2/AAP1基因，该基因可以互补酵母的氨基酸转运缺陷突变体；酵母系统研究植物耐盐性表达基因的功能研究也被广泛应用，Yamada等(2002年)就利用酵母转化子来验证丙二烯环化氧化酶(AOC)基因可以大大提高抗盐性，进一步推测到AOC基因在植物中也可能具有抗盐功能。唐玉林等(2007年)利用酵母研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母转化子的耐盐能力得到显著提高，从而推测SALI3-2基因所具有的抗逆能力。由此可见，利用酵母表达外源蛋白并研究其功能已经得到广泛应用。甲硫氨酸(DL-Methionine)，是含硫必需氨基酸，生物体必须将D-型在体内转化为L-型才能被机体利用。与生物体内各种含硫化合物的代谢密切相关。在生物体内先从ATP接受腺苷基变成S-腺苷酰甲硫氨酸(活性甲硫氨酸)再进行甲基转移。失去甲基的同型半胱氨酸经胱硫醚变成半胱氨酸。5-甲基四氢蝶呤基甘油三酯同型半胱氨酸甲基转移酶(5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteinemethyltransferase-likeMET6)是参与L-蛋氨酸(甲硫氨酸)生物合成新途径的一个酶，它本身也是氨基酸生物合成的一部分。在非生物逆境胁迫(干旱、高盐、低温等)和生物胁迫(病原菌侵染)下，植物5-甲基四氢蝶呤基甘油三酯同型半胱氨酸甲基转移酶mRNA水平更显著升高，一般认为植物5-甲基四氢蝶呤基甘油三酯同型半胱氨酸甲基转移酶参与核苷酸和氨基酸代谢，主要参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径。本专利技术提供了一种苦豆子5-甲基四氢蝶呤基甘油三酯同型半胱氨酸甲基转移酶基因，简称苦豆子半胱氨酸甲基转移酶基因，命名为SaMET6，然而，截至目前的研究中，还无有关苦豆子SaMET6基因在抗逆等生理功能方面的研究报道。
技术实现思路
本专利技术通过构建苦豆子(SophoraalopecuroidesL)盐胁迫(200MmNaCl)和干旱胁迫(8％PEG)全长cDAN文库，并成功重组到酵母表达载体(pYES-DEST52)中，混合质粒载体经转化到酵母菌株INVSc1中，并通过模拟逆境胁迫(NaCl、PEG)，筛选出与逆境胁迫相关的苦豆子基因，通过测序获得基因核酸序列，对该基因进行生物信息学分析，发现该基因可能属于5-甲基四氢蝶呤基甘油三酯同型半胱氨酸甲基转移酶家族基因，简称为苦豆子半胱氨酸甲基转移酶基因，并命名为SaMET6，根据测序获得的序列设计克隆引物和定量引物，同时利用RT-PCR技术检测该基因在逆境胁迫(NaCl，PEG6000)条件下苦豆子不同组织中的表达量变化，以初步研究该基因在苦豆子逆境胁迫中的相应作用，发现SaMET6基因对盐胁迫和旱胁迫表现出了明显的响应，且在根中表达量较高，逆境处理之后表达量明显上调。同时对该基因构建酵母表达载体和植物过表达载体并成功转入酵母BY4743和野生型拟南芥中进行功能初步验证，结果表明转pYES-SaMET6的重组酵母转化子表现出了明显的抗盐胁迫的能力，转pCHF3300-SaMET6拟南芥表现出明显的耐盐性和耐旱性。本专利技术提供了一种苦豆子5-甲基四氢蝶呤基甘油三酯同型半胱氨酸甲基转移酶基因，简称苦豆子半胱氨酸甲基转移酶基因，名称为SaMET6，为序列表中SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。该基因共由1041个碱基组成，完整的开放阅读框含有507bp，同时还含有5’非翻译区序列，开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。本专利技术所提供的蛋白耐干旱和盐胁迫，名称为SaMET6，是一种5-甲基四氢蝶呤基甘油三酯同型半胱氨酸甲基转移酶，来源于苦豆子，植物抗逆相关蛋白SaMET6由序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苦豆子半胱氨酸甲基转移酶基因SaMET6，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种苦豆子半胱氨酸甲基转移酶基因SaMET6，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.一种苦豆子半胱氨酸甲基转移酶SaMET6，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：王庆钰，朱有成，王英，闫帆，刘雅婧，郭文云，李景文，王豆豆，杨旭光，张鑫生，赵磊，蒙佳慧，高子为，刘宇淇，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。