糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新的蒽醌类和黄酮类化合物糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了此酶在生物合成相关糖基转移酶基因的功能；在体外该重组蛋白可以高效地将含有β‑OH蒽醌类化合物和7‑OH或3‑OH黄酮类化合物转化成对应的糖苷。本发明专利技术还提供了含有RyUGT3A基因的重组质粒，可以通过生物工程方法大量合成蒽醌类糖苷和黄酮类糖苷，同时本发明专利技术也提供了一种能大量合成蒽醌类糖苷和黄酮类糖苷的途径，进一步开展蒽醌糖苷和黄酮糖苷生物合成调控研究奠定基础。

Glycosyltransferase gene ryugt3a and its coding protein and Application

【技术实现步骤摘要】
糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白与应用
本专利技术涉及生物技术，尤其涉及一种糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白，以及在生物转化合成特异性蒽醌苷和黄酮苷中的应用。
技术介绍
糖基转移酶(glycosyltransferases，GTs；EC2.4.x.y)家族是一个多成员的基因家族，其中尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases，UGTs)家族是植物体内最大的糖基转移酶家族。其中的GT1家族，是一个由C末端含有44个氨基酸组成的保守序列，且该保守序列被认为是糖基化过程中与UDP-糖的结合的区域，被称为PSPG-box，因此将GT1单独归类为一个尿苷二磷酸糖基依赖的转移酶超家族，其成员主要以UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖，UDP-鼠李糖，UDP-阿拉伯糖和UDP-葡糖醛酸为糖基供体。糖基化反应是植物次生代谢物质合成途径中的常见且重要的下游修饰反应，将受体分子催化连接上糖基，进而影响受体分子在细胞和机体内的生物活性、水溶性、转运性及稳定性等。药用植物中有很多重要活性成分都是糖基化的产物，比如大黄的活性成分大黄素苷，红景天活性成分红景天苷，天麻活性成分天麻素等。鉴于糖基转移酶对植物中重要天然活性产物的糖基化及生理活动过程中重要作用及其在生物合成技术中的越来越突显的应用价值，近几年已引起了学者们的广泛关注。目前，可以通过三种方式获得糖苷类化合物：直接从植物中提取、利用化学合成以及酶催化合成。三种方式相比较来说，直接从植物中提取的工艺相对复杂，且植物中的糖苷类化合物种类多且含量较低，使得整个提取工艺的成本较高。糖类分子上多个可以反应的羟基，使得化学合成法在获得糖基化合物过程中必须加入复杂的基团保护剂以及糖苷合成后的去保护，才能在立体构象和区域位置上特异性合成糖苷键，如此频繁的步骤大大限制了其工业化合成糖苷的实用性，而且一般化学合成中所使用的试剂和生产过程中出现的副产物大多无法实现再利用，容易对环境造成污染。相比而言，酶法糖基化具有立体选择性和区域选择性，步骤简单，环境污染也更小，且符合绿色化学的理念，因此越来越多的人开始关注利用工具酶来催化合成糖苷类化合物。为了找寻到功能新颖且具有一定应用价值的糖基转移酶，本专利技术前期基于紫参(RubiayunnanensisDiels)的化学成分分析(具有含量较高的糖苷类化合物)，然后结合紫参的denovo转录组数据，通过生物信息学的分析，挖掘到了一组具有将蒽醌类和黄酮类化合物特异性糖基化的糖基转移酶，其中一个命名为RyUGT3A，通过生物分子技术进行原核表达，鉴定出其功能对蒽醌类和黄酮类化合物具有较高的转化效率(95％以上)，并且对加糖位点有特异的选择性(主要针对蒽醌类的β-OH和黄酮类的7-OH或3-OH进行糖基化)，而且所合成的糖苷类化合物极为稳定，这些皆有益于提高该酶商业化用途。
技术实现思路
专利技术目的：针对上述现有技术，本专利技术提供了一种糖基转移酶基因RyUGT3A，及其编码蛋白，以及上述基因和蛋白在生物转化合成特异性蒽醌苷和黄酮苷中的应用。技术方案：本专利技术公开了一种糖基转移酶基因RyUGT3A，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。该基因是以紫参根cDNA为模板基因克隆获得，可依赖尿苷二磷酸葡萄糖的蒽醌类和黄酮类糖基转移酶。本专利技术还公开了上述糖基转移酶基因RyUGT3A编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还公开了一种含有上述糖基转移酶基因RyUGT3A的重组质粒。进一步的，所述重组质粒通过将糖基转移酶基因RyUGT3A连接到pET-28a(+)载体的多克隆位点中构建获得，命名为pET-28a(+)-RyUGT3A。上述糖基转移酶基因RyUGT3A或所述编码蛋白在蒽醌糖苷和黄酮糖苷的生物合成中的应用也在本专利技术的保护范围内。具体的，所述糖基转移酶基因RyUGT3A或所述编码蛋白将含β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类化合物转化成对应糖苷。上述重组质粒在蒽醌糖苷和黄酮糖苷的生物合成中的应用也在本专利技术保护范围内。进一步的，通过在大肠杆菌中的表达pET-28a(+)-RyUGT3A，得到RyUGT3A重组蛋白，将含β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类化合物转化成对应的糖苷。有益效果：本专利技术提供了一种新的蒽醌类和黄酮类化合物糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了此酶在生物合成相关糖基转移酶基因的功能；在体外该重组蛋白可以高效地将含有β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类化合物转化成对应的糖苷。本专利技术还提供了含有RyUGT3A基因的重组质粒，可以通过生物工程方法大量合成蒽醌类糖苷和黄酮类糖苷，同时本专利技术也提供了一种能大量合成蒽醌类糖苷和黄酮类糖苷的途径，进一步开展蒽醌糖苷和黄酮糖苷生物合成调控研究奠定基础。附图说明图1为紫参根RNA电泳图；图2为以紫参cDNA为模板扩增糖基转移酶相关基因片段的电泳结果图；图3为转大肠杆菌DH5α菌液PCR电泳结果图；图4为NdeI和XhoI双酶切重组质粒电泳验证图；图5为转大肠杆菌BL21(DE3)菌液PCR电泳结果图；图6为糖基转移酶pET-28a(+)-RyUGT3A融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE凝胶电泳图(纯化前和纯化后)；图7-1-A为标准品6-羟基茜草素及其糖基化产物1和2的UV色谱图；图7-1-B为6-羟基茜草素糖基化产物1和2的质谱图；图7-2-A为标准品大黄素及其糖基化产物的UV色谱图；图7-2-B为大黄素的糖基化产物的质谱图；图7-3-A为标准品2-羟基蒽醌及其糖基化产物的UV色谱图；图7-3-B为2-羟基蒽醌的糖基化产物的质谱图；图7-4-A为标准品2-氨基-3-羟基蒽醌及其糖基化产物的UV色谱图；图7-4-B为2-氨基-3-羟基蒽醌糖基化产物的质谱图；图7-5-A为标准品山奈酚及其糖基化产物的UV色谱图；图7-5-B山奈酚的糖基化产物1和2的质谱图；图7-6-A标准品黄芩素及其糖基化产物1和2的UV色谱图；图7-6-B黄芩素糖基化产物1和2的质谱图；图7-7-A标准品芹菜素及其糖基化产物1和2的UV色谱图；图7-7-B芹菜素和其糖基化产物1和2的质谱图；图8重组酶pET-28a(+)-RyUGT3A动力学参数的检测。具体实施方式下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。本专利技术利用重组DNA技术将紫参糖基转移酶基因RyUGT3A与原核表达载体pET-28a(+)(购自北京擎科新业生物技术有限公司)相连接，构建了融合基因表达质粒表达载体pET-28a(+)-RyUGT3A，转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自北京擎科新业生物技术有限公司)中，诱导表达并纯化获得重组蛋白pET-28a(+)-RyUGT3A，酶功能活性验证表明pET-28a(+)-RyU本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糖基转移酶基因RyUGT3A，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶基因RyUGT3A，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述糖基转移酶基因RyUGT3A编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种含有权利要求1所述糖基转移酶基因RyUGT3A的重组质粒。


4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，将糖基转移酶基因RyUGT3A连接到pET-28a(+)载体的多克隆位点中构建获得，命名为pET-28a(+)-RyUGT3A。


5.权利要求1所述糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭宁华，易善勇，邝彤东，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32