一种提高产溶剂梭菌液体发酵细胞密度的方法技术

一种提高产溶剂梭菌液体发酵细胞密度的方法，其是通过抑制所述产溶剂梭菌中CA_C2730基因的表达来实现。与现有技术相比，本发明专利技术具有如下优势：本发明专利技术提供了一种简单，直接提高产丁醇梭菌液体发酵细胞密度的方法，通过此方法得到的工程菌株在发酵过程中，当以葡糖糖为碳源，在100mL厌氧瓶中发酵时，菌体生长速度加快，丙酮丁醇梭菌细胞密度提高约50％，丁醇产量提高约30％～50％。

A method to increase the cell density of liquid fermentation of Clostridium perfringens

【技术实现步骤摘要】
一种提高产溶剂梭菌液体发酵细胞密度的方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提高产丁醇梭菌液体发酵细胞密度的方法。
技术介绍
生物丁醇是一种重要的化工原料以及具有潜力的燃料。目前研究较为广泛的产丁醇梭菌，分别为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)，在厌氧条件下发酵生产丁醇，同时也伴随其他产物丙酮和乙醇的生产，故丁醇发酵也称为ABE发酵。近年来，梭菌分子水平的操作手段日益发展成熟，在基因层面上对其进行改造的手段也逐渐丰富起来，一些全局性的转录组学，蛋白组学测定也使梭菌生产丁醇过程中的代谢途径更加清楚。为了提高丁醇产量，目前的研究方向主要包括发酵原料的选择、过程工程代谢调控、遗传改造与代谢工程。在原料的选择上，采用价格低廉的原料，如淀粉等作为发酵底物，但是发酵效率偏低，对这些原料的预处理与优化发酵条件的研究就显得很重要，因此多种其他糖类发酵原料也被提出如高粱秸秆、木质纤维素等也被用作ABE发酵的碳源，取得不错的效果。在发酵过程中利用外源添加来调控细胞代谢水平，例如外源添加乙酸或者丁酸能够抑制丙酮丁醇梭菌的产酸代谢，诱导丁醇代谢，在利用木质纤维素作为发酵原料时，培养基中外源添加甘油和别嘌呤醇能够在木质纤维素降解产生的高浓度糠醛胁迫条件下，促进菌体生产以及糠醛脱毒效率，同时提高溶剂代谢。在目前的条件下，低生产率、丁醇产物抑制等发酵中存在的问题，还需要通过诱变育种和基因工程等技术来解决，把生物合成代谢途径朝着目的方向引导，获得所需要的高产菌株，利用关键基因过表达和基因敲除技术对菌株进行遗传改造。例如丙酮丁醇梭菌solR敲除突变菌能更加高效利用葡萄糖，产生较高浓度的溶剂。在细菌中，组氨酸激酶在信号传导中发挥许多功能，组氨酸激酶与它的应答调节蛋白形成双组分信号传导系统，在外界条件的刺激下，将信号传导至下游，从而调控目的基因的表达。目前生物丁醇存在发酵周期长，产量低等情况，基于以上问题与现状，我们专利技术一种提高产丁醇梭菌液体发酵细胞密度的方法来缩短发酵周期并提高生物丁醇的产量。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高产溶剂梭菌液体发酵细胞密度的方法，在液体发酵过程中细胞密度提高，发酵能力上升。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种提高产溶剂梭菌液体发酵细胞密度的方法，其是通过抑制或降低所述产溶剂梭菌中CA_C2730基因的表达来实现，即降低组氨酸蛋白激酶的酶活。其中，所述CA_C2730基因，即组氨酸蛋白激酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；其中，CA_C2730基因编码一种组氨酸蛋白激酶，属于经典的双组分信号传导系统中的一部分，能特异地应对分子信号的刺激，并将信号识别转化成基因激活或者是其他一些细胞反应。其中，所述的抑制产溶剂梭菌中CA_C2730基因的表达通过在其基因内部插入一段DNA片段或删除一段DNA片段实现。优选地，通过ClosTron二型内含子插入失活技术实现。其中，所述的产溶剂梭菌包括Clostridiumacetobutylicum，Clostridiumautoethanogenum，Clostridiumljungdahlii，Clostridiumcarboxidivorans，Clostridiumsaccharobutylicum。优选地，所述的产溶剂梭菌为Clostridiumacetobutylicum。更优选地，Clostridiumacetobutylicum为丙酮丁醇梭菌CGMCCNo.5234或丙酮丁醇梭菌ATCC824；其中，菌株丙酮丁醇梭菌CGMCCNo.5234的具体信息在申请号为201210075094.X的中国专利中详细公开。一种重组产溶剂梭菌也在本专利技术的保护范围之内，其中，该重组产溶剂梭菌中CA_C2730基因的表达已被抑制。优选地，所述的重组产溶剂梭菌为重组丙酮丁醇梭菌。上述重组丙酮丁醇梭菌的构建方法是利用基因敲除技术构建丙酮丁醇梭菌CA_C2730突变菌株。其中，所述的重组丙酮丁醇梭菌的构建方法包括如下步骤：构建敲除质粒pMTL007C-E2-2730，将敲除质粒pMTL007C-E2-2730甲基化后，电转进入丙酮丁醇梭菌CGMCCNo.5234与ATCC824中，筛选得到CA_C2730基因失活的菌株，失活后其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。其中，所述敲除质粒pMTL007C-E2-2730的构建方法包括如下步骤：(1)将核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的内含子连接到载体pMTL007C-E2的HindⅢ和BsrGⅠ酶切位点之间；所述载体pMTL007C-E2的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；(2)将步骤(1)构建得到的质粒转化进入大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，即敲除质粒pMTL007C-E2-2730，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。步骤(1)中，所述内含子的设计方法如下：根据NCBI数据库收录的丙酮丁醇梭菌的CA_C2730基因序列，在内含子设计网站(www.clostron.com)中设计插入位点，选择插入位点在第172bp和第173bp中间，得到核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的内含子序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成至pMTL007C-E2载体HindⅢ与BsrGⅠ之间。步骤(2)中，所述的筛选阳性克隆为构建好的敲除质粒转化进大肠杆菌E.coliDH5α感受态中扩增，涂布到含25ug/mL氯霉素的LB平板上，37℃培养12h，挑取转化子接到液体LB培养基中(含有25ug/mL氯霉素)、37℃、200rpm培养12h，提取重组质粒(AXYGEN)，测序验证，获得CA_C2730敲除质粒pMTL007C-E2-2730。其中，所述的甲基化为将基因敲除质粒pMTL007C-E2-2730转化进入含有pAN2质粒的大肠杆菌E.coliTop10感受态细胞，筛选阳性克隆，即为甲基化的基因敲除质粒。其中，所述的pAN2质粒，该质粒有一个枯草芽抱杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化。其中，所述的筛选阳性克隆为涂布到含25ug/mL氯霉素和10ug/mL四环素(pAN2质粒具有四环素抗性)与的LB平板上，37℃培养12h，挑取转化子接到液体LB培养基中(含有25ug/mL氯霉素和10ug/mL四环素)、37℃、200rpm培养12h，提取甲基化的敲除质粒。上述重组产溶剂梭菌在丙酮-丁醇-乙醇发酵中的应用也在本专利技术的保护范围之内。优选地，上述重组丙酮丁醇梭菌在丙酮-丁醇-乙醇发酵中的应用也在本专利技术的保护范围之内。其中，所述的应用为重组丙酮丁醇梭菌提高发酵细胞密度中的应用；其是通过抑制或降低丙酮丁醇梭菌中CA_C2730组氨酸蛋白激酶的活性来实现提高丙酮丁醇梭菌菌体发酵密度。其中，发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高产溶剂梭菌液体发酵细胞密度的方法，其特征在于，通过抑制所述产溶剂梭菌中CA_C2730基因的表达来实现。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高产溶剂梭菌液体发酵细胞密度的方法，其特征在于，通过抑制所述产溶剂梭菌中CA_C2730基因的表达来实现。


2.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述CA_C2730基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求1所述的方法，所述的抑制产溶剂梭菌中CA_C2730基因的表达通过在其基因内部插入一段DNA片段或删除一段DNA片段实现。


4.根据权利要求3所述的方法，所述的抑制产溶剂梭菌中CA_C2730基因的表达通过ClosTron二型内含子插入失活技术实现。


5.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述的产溶剂梭菌包括Clostridiumacetobutylicum，Clostridiumautoethanogenum，Clostridi...

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，柳东，吴昕洋，王振宇，陈勇，刘庆国，牛欢青，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32