抗非洲猪瘟P30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了抗非洲猪瘟P30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，属于病毒检测技术领域。抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30‑17的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。一种基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，包括以下组成：包被有捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为单域抗体p30‑17；酶标记的检测抗体；所述检测抗体为氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30‑30；标准阳性对照品，血清稀释液，底物显色液A液和显色液B液，终止液和浓缩洗涤液。所述试剂盒能够实现快速、准确检测并且检测特异性好。

Single domain antibody against African swine fever P30 and ELISA kit for detection of African swine fever virus

【技术实现步骤摘要】
抗非洲猪瘟P30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒
本专利技术属于病毒检测
，具体涉及抗非洲猪瘟P30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的急性、高度接触性传染病、病死率可高度达100％，世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟病毒归属于双链DNA病毒目、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，并且是该病毒科唯一成员。非洲猪瘟病毒p30蛋白是病毒感染早期产生的蛋白，是由CP204L基因编码的大小约为30kD的蛋白，由于其较强的免疫原性，而且p30能够诱导机体产生很强的免疫应答，通常被用做诊断抗原。非洲猪瘟的临床症状和古典猪瘟、猪繁殖与综合征的极为相似，无法进行鉴别诊断，只能通过实验室的病原学和血清学方法进行确诊。病原学诊断包括(1)病毒的分离培养及红细胞吸附试验，红细胞吸附试验是检测非洲猪瘟的金标准；(2)基于病毒核酸的分子生物学诊断方法，主要包括PCR、qPCR、LAMP等。血清学诊断方法包括间接ELISA、竞争ELISA、双抗夹心ELISA、间接免疫荧光法、直接免疫荧光法、免疫印迹法等，但是PCR和qPCR方法对技术人员和仪器的要求较高，且很容易造成污染、出现假阳性等缺点，而ELISA检测方法具有耗时短、对技术人员要求低、成本低、适合大批量检测等优点。虽然目前ELISA检测非洲猪瘟病毒的方法，缺乏特异性强的抗体。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供抗非洲猪瘟P30蛋白单域抗体所述单域抗体具有较强的抗原亲和性。本专利技术的目的还在于提供基于双抗夹心法检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒具有快速、准确且特异性强的特点。本专利技术提供了抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30-17，所述抗非洲猪瘟P30蛋白的单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术提供了一种基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，包括以下组成：包被有捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单域抗体p30-17；酶标记的检测抗体；所述检测抗体为氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-30；标准阳性对照品；血清稀释液；底物显色液A液和TMB显色液B液；终止液；和浓缩洗涤液。优选的，所述捕获抗体的包被浓度为5～7.5μg/mL。优选的，所述包被有捕获抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：用包被液将捕获抗体稀释成捕获抗体溶液，添加到酶标板的微孔中，4℃包被过夜；洗涤过夜后的酶标板，用PBST溶液洗涤3次，去除水分，加入封闭液，37℃封闭1h，洗涤酶标板，用PBST溶液洗涤3次，去除水分，得到包被有捕获抗体的酶标板。优选的，所述封闭液为含有体积浓度5％的牛血清的pH值7.4值的PBS溶液。优选的，所述包被液为pH值9.4的磷酸盐缓冲液。优选的，所述酶标记的检测抗体的稀释度为1:1000～2000。优选的，所述浓缩洗涤液为25倍浓缩洗涤液，所述浓缩洗涤液为含有体积浓度0.5％吐温的pH值7.4的磷酸盐缓冲液。优选的，所述血清稀释液以500mL的蒸馏水为溶剂，包括以下含量的组分：NaCl8.5g、NaH2PO4·2H2O0.356g、Na2HPO4·12H202.772g，pH值为7.2～7.4。优选的，所述ELISA试剂盒的最低检出限为21.8ng/ml。本专利技术提供了抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30-17，所述抗非洲猪瘟P30蛋白的单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。经过方阵滴定法确定抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30-17与非洲猪瘟病毒P30蛋白抗原的亲和性，结果表明，所述单域抗体p30-17对非洲猪瘟P30蛋白具有较强的亲和性。本专利技术提供了一种基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，分别以抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单域抗体p30-17作为捕获抗体和抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单域抗体p30-30作为检测抗体，基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒，能够实现快速、准确检测，检测阳性率达到100％。经过交叉实验发现，本专利技术提供的试剂盒只和非洲猪瘟病毒抗原发生反应，不和口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒均不发生反应，特异性为100％。同时，本专利技术提供的检测试剂盒具有检测灵敏高的特点，实验表明最低检出限为21.8ng/ml。批间和批内重复性检测表明，具有良好的检测重复性。根据敏感性、特异性和重复性检测结果，3批次非洲猪瘟病毒试剂盒分别检测到20份阳性样本和30份阴性样本，与样本背景一致，符合率达到100％。附图说明图1为最佳封闭液的筛选结果。具体实施方式本专利技术提供了抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30-17，所述抗非洲猪瘟P30蛋白的单域抗体的氨基酸序列为QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTFSRYCMGWFRQAPGKEREEVARIDSDGSTNYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADRRRYCRFQGPGDGMDYWGKGTQVTVSS(SEQIDNo.1)。所述单域抗体p30-17包含125个氨基酸。本专利技术对所述单域抗体p30-17的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知单域抗体的来源即可。在本专利技术中，抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30-17由p30蛋白免疫骆驼后采集骆驼抗凝血，提取总RNA，反转录为cDNA后构建噬菌体展示文库，使用p30蛋白进行亲和筛选后得到。所述抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30-17的制备方法，优选包括以下步骤：1)将p30-17的编码序列连接至表达载体pet-30a表达载体(酶切位点为EcoRI和XhoI)，构建得到原核表达载体；2)将原核表达载体经过阳性菌落鉴定，筛选得到的阳性菌液按照1:100加入到TB培养基中进行扩大培养至OD值为3.0后，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，6h后收集菌体，超声破碎后将沉淀用裂解液重悬，得到重悬液；3)使用不同浓度的咪唑纯化所述重悬液，得到抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30-17。在本专利技术中，所述纯化的方法采用本领域所熟知的抗体纯化方法即可，例如参考申请号为201910059243.5的中国专利。纯化后的抗体优选包括经过氨基酸序列进行验证。本专利技术提供了一种基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，包括以下组成：包被有捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单域抗体p30-17；酶标记的检测抗体；所述检测抗体为氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-30；...

【技术保护点】
1.抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30-17，其特征在于，所述抗非洲猪瘟P30蛋白的单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单域抗体p30-17，其特征在于，所述抗非洲猪瘟P30蛋白的单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.一种基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，其特征在于，包括以下组成：
包被有捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单域抗体p30-17；
酶标记的检测抗体；所述检测抗体为氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-30；
标准阳性对照品；
血清稀释液；
底物显色液A液和TMB显色液B液；
终止液；
和浓缩洗涤液。


3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体的包被浓度为5～7.5μg/mL。


4.根据权利要求2或3所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被有捕获抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：
用包被液将捕获抗体稀释成捕获抗体溶液，添加到酶标板的微孔中，4℃包被过夜；
洗涤过夜后的酶标板，用PBST溶液洗涤3次，去除水分，加入封闭液，37℃封闭1h，洗涤酶标板，用P...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志杰，赵亚茹，杨吉飞，牛庆丽，刘光远，罗建勋，关贵全，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62